BAKTERLERN ZOLASYON VE DENTFKASYONLARI 1 ZOLASYON VE DENTFKASYON
BAKTERİLERİN İZOLASYON VE İDENTİFİKASYONLARI 1
İZOLASYON VE İDENTİFİKASYON İzolasyon (Kültür): Bakterilerin uygun besiyerlerinde üretilmesi. Laboratuvara getirilen örneklerden uygun besiyerlerine ekim (inokulasyan) yapılarak bakterilerin üretilmesi, çoğaltılmasına İzolasyon adı verilir. n İdentifikasyon: Bakterilerin üretildikten sonra çeşitli testler yapılarak isimlendirilmesine identifikasyon adı verilir. n n Hastalık etkenini identifiye edebilmek için saf olarak üretmek gereklidir. Bunun için de, izolasyonu şarttır. Etkenin erken izolasyonu; koruyucu ve sağaltıcı gerekli önlemleri zamanında almak bakımından da çok önemlidir. 2
İNFEKSİYONLARIN TEŞHİSİ 1. Anamnez 2. Klinik bulgular (Marazi madde (örnek) alınması) (Laboratuvar muayeneleri) 3. Nekropsi (otopsi) bulguları (Marazi madde (örnek) alınması) 4. Labortuvar muayeneleri (Mikrobiyoloji) 1. 2. 3. 4. 5. Bakteriyoskopi (Boyama Yöntemleri) Kültür (izolasyon, identifikasyon) Deneme hayvanlarına inokulasyon Serolojik ve allerjik testler Diğer testler (Faj Tiplendirme, Moleküler Yöntemler-PCR, Toksin Aranması vs. ) 3
1. Anamnez (Hastalığın hikayesi, geçmişi) n Hastalık ve hasta hakkında, teşhise yönelik çok İnfeksiyonların Teşhisi önemli ip uçları elde etmede, hasta sahibinden bilgiler elde etmek ve bunları değerlendirmek, hem klinik teşhise ve hem de laboratuar muayenelerine bir yön vermesi bakımından önemlidir. n Bir hastalığın nasıl ve ne zaman başladığı, ne şekilde geliştiği ve seyrettiği hakkında ilk bilgiler teşhis için büyük değere sahiptir. n Bunlar, klinik ve otopsi bulguları ile laboratuar muayeneleri birlikte değerlendirilerek sonuca (teşhise) varılır. 4
İnfeksiyonların Teşhisi 1. Anamnez (Hastalığın hikayesi, geçmişi) «Bazı durumlarda, «laboratuvara sadece muayene maddesi gönderilir veya getirilir. «Bu madde, «bunun alındığı hasta ve hastalık (çıkış, seyir vs. ) hakkında ya getirenden veya gönderilen yerden yeterince bilgi alınmalı «ve bunlara dayanılarak laboratuar muayenelerine bir yön verilmelidir. 5
İnfeksiyonların Teşhisi 2. Klinik bulgular n İnfeksiyon hakkında ilk ve önemli bilgiler hastanın gösterdiği klinik semptomlardan elde edilir. n Genel semptomlar (iştahsızlık, durgunluk, ateş, terleme, titreme, kabızlık, baş ağrısı, vs. ) n Özel semptomlar (solunum, sindirim, ürogenital, sinir, dolaşım sistemi bozukluklarına ait klinik semptomlar, vs) 6
2. Klinik bulgular İnfeksiyonların Teşhisi n Hastalığın teşhisinde özel semptomlar büyük ölçüde yararlı olurlar. n Perakut seyreden vakalarda, genellikle özel semptomlar çok az veya belirsiz olarak ortaya çıkarlar. Bu nedenle perakut olguların teşhisi klinik yönünden güçtür. n İnfeksiyonun seyri akut, subakut veya kronik şekilde ise, hastalığı tanımlayan özel klinik belirtiler daha fazla ortaya çıkarlar. 7
2. Klinik bulgular İnfeksiyonların Teşhisi n Klinik belirtiler, hasta ve/veya sahibinden alınan bilgiler yanı sıra; n hastanın dikkatlice sistematik muayenesi sonunda da önemli ip uçları elde edilebilir. n Hastadan, teşhise yardımcı olmak üzere bazı marazi maddeler n (kan, biyopsi materyalleri, idrar, kraşe, gaita, ponksiyon sıvıları, yara, lenf düğümü, apse içerikleri, omurilik sıvısı, deri kazıntısı, vs. ) alınır n ve bunlar mikrobiyolojik ve biyokimyasal yönden incelenirler. 8
İnfeksiyonların Teşhisi 2. Klinik bulgular n Bir infeksiyona ait tüm semptomları aynı bireyde görmek mümkün olmayabilir. n Bu nedenle aynı hastalığa yakalanmış diğer hayvanlar varsa, bunların da muayeneleri uygun olur ve gerekirse bunlardan da gerekli patolojik maddeler alınır. n Ayrıca, hastalar için yapılan fiziksel muayeneler (röntgen, ultrasonografi ve diğerleri), n biyokimyasal tetkikler (şeker, lipid, vs. ), n hematolojik incelemeler n ve diğerleri hastalığın teşhisine büyük katkıda bulunur. 9
3. Nekropsi (Otopsi) Bulguları n İnfeksiyonlar sonucu ölenlere gerektiğinde hemen İnfeksiyonların Teşhisi ve usulüne uygun olarak nekropsi (otopsi) yapılır. n Şüphelenilen organlar dikkatlice gözden geçirilir. n Ancak, klinik belirtilere göre üzerinde durulan hastalığın yerleşebileceği sistem veya organlar daha dikkatli incelenir. n Görülebilen lezyonların yeri, büyüklüğü, şekli ve diğer özellikleri kaydedilir. n Patolojik bulgulara göre hastalık hakkında tamamlayıcı bilgiler elde edilir. 10
Örnek (Marazi madde) Alınması Alınan marazi maddelerin histopatolojik yönden muayeneleri uzman kişiler tarafından yapılarak topluca bir değerlendirmeye gidilir. n İnceleme amacı ile alınacak maddeler, hasta canlı iken (biyopsi) veya öldükten sonra (nekropsi) alınırlar. n Hastalığın karakterine, yerleştiği organa ve etkenin vücuttan dışarı çıkma durumuna göre materyaller değişebilir. 1. Muayene maddeleri çok taze olmalı ve yeteri miktarda alınmalıdır 2. Hastadan, ateşli dönemde materyal alınması tercih edilmelidir. Çünkü, kanda fazla miktarda etkene rastlamak mümkündür. 11 İnfeksiyonların Teşhisi n
Örnek (Marazi madde) Alınması «Ateşli durumda iken genellikle kan alınarak İnfeksiyonların Teşhisi hemokültürler yapılır. Virolojik yönden de ekimler uygulanır. Kanda bulunan etken, kan aracılığı ile bütün dokulara veya organlara yayılma olanağı bulur. «Kronik devrede ise, genellikle, kanda m. o. yoktur. Etkenler doku ve organlara yerleşir ve burada da bozukluklar meydana getirirler. 12
Örnek (Marazi madde) Alınması İnfeksiyonların Teşhisi «Hastalık etkenleri vücuttan çeşitli sekret (süt, sperma, tükrük, v. s. ) ve ekskretlerle (idrar, gaita, kraşe, burun akıntıları, uterus akıntıları, v. s. ) dışarı atılırlar. « Bu nedenle bu maddelerden yeterince alınarak gerekli muayeneler ve ekimler uygulanır. «Bazı durumlarda materyalleri (idrar, süt, gaita, kan, v. s. ) gün aşırı veya belli periyotlarla almak uygun olur. 13
İnfeksiyonların Teşhisi Örnek (Marazi madde) Alınması 3. Ölüm olgularında, hemen ve zaman geçirmeden (gerekli ise) şüphelenilen veya lezyonlu doku ve organlardan aseptik koşullarda ve yeterince marazi maddeler alınır. 4. Materyaller antibiyotik veya kemoterapötik maddelerin uygulanmadığı hastalardan veya antibiyotik uygulamasından önce alınmalıdır. Eğer antibiyotik uygulanmışsa, vücuttan atılma süresini bekleyip ondan sonra materyal alınmalıdır. 5. Muayene maddelerinin, eğer mümkünse, birkaç hastadan alınması, etken izolasyon şansını arttırabilir. 6. Muayene maddeleri aseptik koşullarda alınmalı ve steril kaplara konarak hemen soğukta muhafaza edilmelidir. 14
Laboratuvara Örnek (Marazi madde) Gönderilmesi İnfeksiyonların Teşhisi n Materyaller alındıktan sonra, vakit kaybetmeden laboratuvara göndermelidir. n Eğer, laboratuvar uzaksa, dondurulduktan sonra termoslar içinde en seri vasıta ile göndermelidir. n Alınan kanların usulüne uygun olarak serumu çıkarılır ve gönderilir. Eğer isteniyorsa sitratlı kan veya serumu çıkarılmamış kan da gönderilebilir. n Gerek görülüyorsa, kandan frotiler yapılarak muayene için laboratuarlara gönderilebilir. n lenf düğümü, yara, apse içerikleri, deri kazıntıları, süt, sperma, ponksiyon sıvıları usulüne uygun olarak alınır ve hemen laboratuara gönderilir. 15
4. Labratuvar muayeneleri (Mikrobiyoloji) n Hastalık etkenlerinin direkt ve indirekt İnfeksiyonların Teşhisi teşhislerinde mikrobiyolojik muayenelerinin önemi çok fazladır. n Klinik ve otopsi bulguları ile laboratuar muayeneleri sonucunda elde edilen bilgiler, birleştirilerek kesin teşhise gidilir. 1. Bakteriyoskopi 2. Kültür (izolasyon, identifikasyon) 3. Deneme hayvanlarına inokulasyon 4. Serolojik, allerjik ve diğer testler 16
4. Labratuvar muayeneleri (Mikrobiyoloji) İnfeksiyonların Teşhisi 1. Bakteriyoskopi 2. Kültür (izolasyon, identifikasyon) 3. Deneme hayvanlarına inokulasyon 4. Serolojik ve allerjik testler 5. Diğer testler (Faj Tiplendirme, Moleküler Yöntemler-PCR, Toksin Aranması vs. ) 17
1. Bakteriyoskopi n Gönderilen biyopsi ve/veya nekropsi materyallerinden usulüne uygun olarak ince preparatlar hazırlanır ve basit (metilen mavisi, bazik fuchsin, vs. ) veya bileşik boyama (Gram, Ziehl Neelsen, Giemsa, vs. ) yöntemlerinden biriyle boyanırlar. n Boyama yöntemleri, şüphelenilen hastalığa göre değişebilir. n Örn, tüberküloz, leptospira, klamidia, ve pastörella infeksiyonlarında özel boyama teknikleri kullanılır. n Diğer infeksiyon etkenleri için Gram boyama genellikle yeterlidir. 18
1. Bakteriyoskopi «Bazı durumlarda şüphelenilen spesifik etkeni görmek mümkündür. «Ancak, kesin karar vermek yerine daha dikkatli bulunarak, «diğer laboratuar muayenelerinin teyit edici sonuçlarını beklemek yerinde ve iyi bir tedbir olur. 19
4. Labratuvar muayeneleri (Mikrobiyoloji) İnfeksiyonların Teşhisi 1. Bakteriyoskopi 2. Kültür (izolasyon, identifikasyon) 3. Deneme hayvanlarına inokulasyon 4. Serolojik ve allerjik testler 5. Diğer testler (Faj Tiplendirme, Moleküler Yöntemler-PCR, Toksin Aranması vs. ) 20
2. Kültür n Gönderilen muayene maddelerinden, araştırılması istenen hastalık yönünden, genel veya özel katı ve sıvı besiyerlerine ekimler yapılarak etkenin üretilmesidir. n Besiyerleri (kültürler), optimal ısı derecesinde, n ve araştırılan hastalık etkeninin karakterine göre, aerobik, mikroaerofilik veya anaerobik koşullarda uygun bir süre inkübasyona bırakılır (etüv, inkübatör). n İnkübasyon süresi, etkenlere göre değişir. n Bazı hastalık etkenleri için canlı ortamlardan yararlanılır. n Bazı hastalıklarda zenginleştirme besi yerleri ve bundan sonra özel selektif ve diferensiyel ortamlar kullanılır. 21
2. Kültür n Katı besi yerlerinde hastalık etkenini üretmek ve izole etmek için, ekim veya özel yayma teknikleri (öze ile ekim-çizmek, sıvap ile, yayma, dokundurma vs. ) kullanılır n ve mümkün olduğu kadar mikroorganizma tek olarak düşürülmeye, tek koloni elde edilmeye çalışılır. n Mikroorganizma izolasyonları katı ortamlarda yapıldığından, bu besiyerlerinin istenen mikroorganizmayı en iyi şekilde üremesini sağlayacak, buna karşılık istenmeyenlerin üremesini sınırlayacak veya üretmeyecek durumda olması arzu edilir. 22
2. Kültür n Bu nedenle çeşitli hastalık etkenleri için optimal üreme sağlayacak özel selektif katı besiyerleri yapılmıştır. n Katı veya sıvı besi yerlerine, genellikle, lezyonların bulunduğu yerden ve kenarlarından alınan maddeler ekilirler. n Hastalık etkenlerinin yüksek oranda izolasyon şansını artırmak için, her hastalıkta özel uygulanan izolasyon teknikleri vardır (zenginleştirme, inkübasyon vs). 23
4. Labratuvar muayeneleri (Mikrobiyoloji) İnfeksiyonların Teşhisi 1. Bakteriyoskopi 2. Kültür (izolasyon, identifikasyon) 3. Deneme hayvanlarına inokulasyon 4. Serolojik ve allerjik testler 5. Diğer testler (Faj Tiplendirme, Moleküler Yöntemler-PCR, Toksin Aranması vs. ) 24
3. Deneme hayvanı inokulasyonu 4. Labratuvar muayeneleri n Muayene maddelerinden yapılan suspansiyonlardan veya besi yerlerinde üreyen şüpheli kolonilerden duyarlı deneme hayvanlarına enjeksiyonlar yapılır. n Bu amaçla fare, kobay, tavşan, tavuk, vs. fazla kullanılır. n Deneme hayvanlarının ve inokulasyon yollarının seçimi, araştırılan hastalığa göre değişir. n Deneme hayvanlarının enjeksiyondan önce sağlıklı ve kondisyonlarının iyi olması şarttır. 25
4. Labratuvar muayeneleri (Mikrobiyoloji) İnfeksiyonların Teşhisi 1. Bakteriyoskopi 2. Kültür (izolasyon, identifikasyon) 3. Deneme hayvanlarına inokulasyon 4. Serolojik ve allerjik testler 5. Diğer testler (Faj Tiplendirme, Moleküler Yöntemler-PCR, Toksin Aranması vs. ) 26
4. Labratuvar muayeneleri 4 - Serolojik, allerjik ve diğer testler n Hasta hayatta iken alınan kan serumları vasıtasıyla birçok hastalıklar teşhis edilebilmektedir. n Brucellosis, malleus, paratüberculosis, leptospirosis, salmonellosis, listeriosis, vibriosis v. s. gibi hastalıklarda genellikle aglutinasyon ve komplement fikzasyon testleri uygulanır. n Viral hastalıklarda da hemaglutinasyon, hemaglutinasyon-inhibisyon (HI) ve nötralizasyon testleri fazlaca kullanılır. n Katı besiyerlerinde üreyen kolonilerle lâm üzerinde yapılan çabuk aglutinasyon testleri, etkenin teşhisine büyük ölçüde yardımcı olur. n AGP (Agar Gel Presipitasyon) 27
4 - Serolojik, allerjik ve diğer testler 4. Labratuvar muayeneleri n Hastalıkların türüne göre kullanılmak üzere diğer birçok ileri serolojik yöntemler daha bulunmaktadır (ELISA, RIA, IFA, vs. ). Bunlar da aynı şekilde yararlar sağlayabilirler. n Alerjik reaksiyonlardan malleus, tüberkülozis ve paratüberkülozisin indirekt teşhisinde fazlaca yararlanılır. Reaksiyon için özel alergenler (mallein, tüberkülin, johnin PPD) kullanılır. n Moleküler Yöntemler (Elektroforez, PCR) 28
4. Labratuvar muayeneleri (Mikrobiyoloji) İnfeksiyonların Teşhisi 1. Bakteriyoskopi 2. Kültür (izolasyon, identifikasyon) 3. Deneme hayvanlarına inokulasyon 4. Serolojik ve allerjik testler 5. Diğer testler (Faj Tiplendirme, Moleküler Yöntemler-PCR, Toksin Aranması vs. ) 29
4. Labratuvar muayeneleri 4 - Serolojik, allerjik ve diğer testler n Faj Tiplendirme n Toksin aranması n Moleküler Yöntemler n (Elektroforez, PCR) 30
BAKTERİLERİN İDENTİFİKASYONLARI 1. Morfolojik Özellikleri 2. Kültürel Özellikleri 3. Fizyolojik Özellikleri 4. Biyokimyasal Özellikleri 5. Patojenite–Toksijenite 6. Antijenik–Serolojik Özellikler 7. Bakteriyofaj Duyarlılığı 8. Biyoteknolojik Yöntemler 9. Metabolik Özellikler 10. Genetik Özellikler 31
Bakterilerin İdentifikasyonları 1. Morfolojik Özellikleri n Uygun sıvı veya katı ortamlarda saf olarak üretilen bakterilerden hazırlanan preparatlar özel boyalarla boyanarak incelenirler. n Mikroskop altında, bakterilerin; n bireysel formları (yuvarlak, oval, kokoid, çomak, kokobasil, virgül, spiral, pleomorfik, vs. ), n büyüklüğü (küçük, büyük, vs. ), n dizilişi (küme, zincir, flament, vs. ), n spor durumu (var veya yok, varsa terminal, subterminal, sentral, lateral, vs. ), granül (var veya yok), n boyanma özelliği (Gram negatif veya pozitif, asido rezistans, homojen boyanma, vs. ), n flagella vs. incelenir. 32
Bakterilerin İdentifikasyonları 2. Kültürel Özellikleri n Katı ve sıvı ortamlardaki saf kültürleri kullanılır. n a) Katı ortamlarda koloni morfolojileri: n b) Sıvı ortamda üreme özellikleri: n Uygun sıvı besi yerlerinde bakteriler, belli bir süre sonra, bol, zayıf veya orta derecede bir üreme yeteneğine sahiptirler. n Bazıları üstte pellikül, dipte tortu, saç gibi, veya granüllü bir üreme gösterirler. n Üremenin türleri besi yerinin bileşimi, inkubasyon sıcaklığı ve süresine bağlı olduğu gibi, o türün genetik bir karakteridir. 33
Bakterilerin İdentifikasyonları 3. Fizyolojik Özellikleri n Bakterilerin cinslerine göre fizyolojik karakterleri de değişmektedir. n Üreme ısıları, n inkübasyon süreleri, n oksijene ihtiyaç durumları, n besi yerinin bileşimi ve diğer fizyolojik özellikleri 34
Bakterilerin İdentifikasyonları 4. Biyokimyasal Özellikleri n Mikroorganizmaların identifikasyonlarında biyokimyasal aktivitenin belirlenmesi çok önemidir. n Bu amaçla, çok değişik testler kullanılır. n Bunlar arasında; n karbonhidrat fermantasyonu, H 2 S, indol, MR, VP, sitrat, nişasta, jelatin, üre, katalaz, oksidaz, koagulaz vs. gibi testler, mikroorganizmaların türüne göre seçilerek kullanılır. 35
5. Patojenite–Toksijenite Bakterilerin İdentifikasyonları n Bakterilerin hastalık oluşturma yetenekleri bunlarda bulunan virulens faktörleri ile yakından ilişkilidir. n Virulens faktörleri patojenik ve toksijenik özelliklerini de kapsamaktadır. n Başlıca virulens faktörleri arasında adhezinler, (fimbrialar dahil) ekzotoksinler, toksik substanslar, kapsül, endotoksin, çeşitli enzimler, homolizinler vs. bulunmaktadır. n Bazı bakterilerin virulensleri, taşıdıkları plasmid ve faja bağımlıdır. Bazılarında da bu karakterler kromozomal bir özellik taşır. 36
Bakterilerin İdentifikasyonları 6. Antijenik–Serolojik Özellikler n Bakteriler, kendilerinin çeşitli yerlerine lokalize olmuş ve yapısal bir karakter taşıyan değişik antijenik substanslara sahiptirler. n Bunların başlıcaları arasında; kapsül, mikrokapsül, pilus, flagella, hücre duvarı, sitoplasmik membran, spor ve diğer komponentler sayılabilir. n Bunların bir bölümü protein ve polisakkarid, diğerleri de kompleksler (glikoprotein, lipopolisakkarid, lipoprotein, vs. ) halindedirler. n Toksijenik olanlarda; toksin ve toksik metabolitler antijenik özelliktedirler. n Bakterilerin antijenik substanları vücutta antikor sentezini uyardıklarından serolojik tiplendirmede de önemli rol oynarlar. Bu amaçla çeşitli serolojik testler (CF, SAT, ELISA, RIA, FA, AGP, peroksidase, vs. ) 37 kullanılabilir.
Bakterilerin İdentifikasyonları 7. Bakteriyofaj Duyarlılığı n Bakteriyofajlar; hem izolatların tiplendirilmesinde ve hem de klasifikasyonunda yardımcı olur. n Eğer mevcut spesifik fajlar varsa, bunlardan yararlanılarak teşhise katkıda bulunulur. n Ancak fajla teşhis ikinci derecede düşünülmelidir. Çünkü, aynı tür içinde bile spesifik faj'a karşı hem duyarlı ve hem de duyarsız olanlar çıkabilir. 38
Bakterilerin İdentifikasyonları 8. Biyoteknolojik Yöntemler n İzolatların kesin teşhisinde ileri tekniklerden olan hibridizasyon yöntemleri (Southern blot, Northern blot, dot blot, vs. ) ve diğer ileri teknikler kullanılabilir. n PCR (Polymerase Chain Reaction) ile birleştirilen teknikler son zamanlarda fazla kullanılmaktadır. 39
Bakterilerin İdentifikasyonları 9. Metabolik Özellikleri n Bakterilerin sentezlediği ekzo-ve endoenzimlerin ve diğer çeşitli metabolitlerin türü, miktarı, etkinliği ve yapısı birbirlerinden farklar gösterirler. n Mantarlar da birçok enzim ve değişik sekonder metabolitler sentezler ve bunlar da türler arasında farklar gösterir. 40
10. Genetik Özellikleri Bakterilerin İdentifikasyonları n Bakterilerin genetik materyalleri, kompozisyon bakımından farklar gösterirler. n Türler arasında baz sırası ve sayısı hemen aynı ve sabit olmasına karşın, aynı cinsin farklı türleri arasında da değişiklik bulunmaktadır. Özellikle, G+C oranın % olarak değeri türler arasında ayrımda kullanılır. n Genetik yönden yakınlıkları saptamada DNA'daki baz homologluk oranının belirlenmesi önem taşır ve bu hibridizasyon yöntemleri ile belirlenir. n Bakterilerin bazılarında bulunan plasmid, transpozon ve İS-elementleri de bakterilere bazı özellikler kazandırır (antibiyotiklere dirençlilik, antijenik özellikler, virulens faktörleri, vs. ) 41
- Slides: 41