BAKTERLERN METABOLZMASI ZOLASYON retme VE DENTFKASYON tanmlama YNTEMLER

BAKTERİLERİN METABOLİZMASI İZOLASYON (Üretme) VE İDENTİFİKASYON (tanımlama) YÖNTEMLERİ Prof. Dr Mehmet KIYAN

Hedefler l l l Bakteri metabolizmasını tanımlama Bakterilerin üremesi için gereken enerji ve karbon kaynaklarını sıralama Bakterilerin üremesi için gerekli olan fiziksel şartları sıralama l l Mikroorganizmaların üreme hızları ve dönemlerini tanımlama Besiyerlerini tanımlama Tek koloni düşürme, ekim, pasaj ve koloniyi tanımlama Mikrobiyolojik örneklerin ekim tekniklerini tanımlama

Hedefler l l l İçerik ve kullanım amaçlarına göre besiyerlerini sınıflandırma Bakterilerin katı ve sıvı besiyerlerindeki üreme görünümlerini tanımlama Katı besiyerlerinde üreyen bakterilerin koloni özelliklerini tanımlama l Kanlı agarda üreyen bakterilerin hemoliz özelliklerini değerlendirme l l l Antibakteriyel duyarlılık testini tanımlama Bakterilerin enzim sistemlerini tanımlama Bakterilerin idantifikasyonu amacıyla kullanılan testleri ve besiyerlerini tanımlama

Tanımlar Metabolizma: Katabolizma: Bir canlı içerisinde meydana gelen kimyasal reaksiyonların tümüne Metabolizma denir. l Canlılarda meydana gelen anabolizma ve katabolizma olaylarının tümüdür. l Mikroorganizmalarda 2. 000 kadar farklı kimyasal reaksiyon vardır. Alınan besin maddelerinin yıkılıp enerji açığa çıkması olayına denir. Böylece mikroorganizma için gerekli enerji temin edilmiş olur. Anabolizma: Mikroorganizmanın yaşamını sürdürebilmesi ve çoğalması için gerekli sentez işlemlerinin tümüdür. Sentez işlemi için gerekli enerji, genellikle adenozin trifosfat (adenosine triphosphate = ATP) tarafından karşılanır.

Tanımlar Holozoik canlılar: Bulundukları ortamdan sıvı maddeler yanında katı besin parçacıklarını özelleşmiş organ ve organelleri içerisine alarak beslenen organizmalardır. l l l Protozoerler İnsanlar Hayvanlar Holofitik canlılar : Bulundukları ortamdaki katı besin maddelerini hücre dışında küçük parçalara ayırıp sindirdikten sonra kendi içine alıp onlardan yararlanan canlılardır. l l Bakteri Mantar

Tanımlar Fototrof : Organotrof: Enerjilerini fotosentez yolu ile güneşten alırlar. Klorofile benzer fotosentetik pigmentleri vardır. Organik maddelere gereksinim göstermeksizin yaşayabilirler. Kemotrof: Gerekli enerjiyi inorganik maddelerdeki veya organik moleküllerdeki kimyasal bağın parçalanması ile sağlarlar Enerjilerini organik bileşiklerden (şekerler, aminoasitler) alırlar. Bakterilerin çoğu organotroftur. Litotrof: Enerjilerini azot-demirsülfür içeren inorganik maddelerden sağlarlar. Bazı bakteriler litotroftur.

Tanımlar Ototrof: Kemoototrof: Organik maddelere gereksinim göstermeksizin, besin maddesi olarak basit inorganik maddeleri (Na. Cl, K 2 HPO 4, Fe. Cl 3, Mg. SO 4) karbonatları veya atmosferdeki karbondioksidi kullanırlar. Gerekli enerjiyi inorganik maddelerin oksidasyonundan elde ederler. Bazı mikroorganizmalar güneş enerjisine gerek duymayabilirler.

Tanımlar l Heterotrof: Ototroflardan farklı olarak beslenebilmek için en az bir tane organik madde bileşiğine gereksinim duyarlar. l l Fotoheterotrof: Enerjilerini gün ışığından alırlar Kemoheterotrof: (Kemoorganotrof) Enerjilerini kimyasal reaksiyonlardan elde ederler l l l Bakterilerin çoğu şeker, aminoasit gibi organik maddeleri parçalayarak enerji elde ederler. Tüm mikroorganizmaların karbon kaynaklarına gereksinimleri vardır. Bakterilerin çoğu kemoheterotroftur.

Tanımlar Saprofit mikroorganizmalar: Kemoorganotrof mikropların bir kısmı başka canlıların metabolizma artıkları veya ölü kısımlarında bulunan organik maddelerle beslenirler. Bu ilişkiden iki tarafta zarar görmez. Parazit: Üzerinde yaşadıkları organizmaya zarar verip hastalık oluşturan mikroorganizmalardır. l l Obligate ( zorunlu ) parazit: Cansız besleyici ortamlarlarda yaşayamazlar Fakültatif ( değişebilen ) parazit: Cansız besleyici ortamlarlarda yaşayabilirler.

Bakteri Metabolizması l l l Bakteriler aktif canlılardır. Uygun bir çevresel ortamda sürekli olarak metabolizmaları devam eder ve sayıları sürekli artar. Bakterilerin hızlı çoğalması onların laboratuvarlarda invitro şartlarda üretilmesini ve hastalıkların teşhisine imkan verir. l l Bakterilerin üreyebilmeleri için uygun fiziksel, kimyasal koşulların var olması ve besin maddelerinin bulunması gerekmektedir. Bakteriler aminoasitleri, karbohidratları ve lipitleri elde etmek veya sentezlemek zorundadırlar.

Bakteri Metabolizması l Bakterilerin üreyebilmek için gerekli olan minimal ihtiyaçlar: l l l karbon kaynağı, azot kaynağı, enerji kaynağı, su, değişik iyonlar. Patojen bakteriler enerjilerini şekerleri, lipitleri, karbohidratları metabolize ederek elde ederler. l l l Bazı bakteriler kolay ürerlerken bazılarının da üreme gereksinimleri çok fazladır. Hücre içinde meydana gelen kimyasal olayların tamamı metabolizmayı oluşturur. Virusların bir hücre yapısı ve metabolizmaları olmadığı için metabolik enzimleri de yoktur.

Bakteri Metabolizması l Bakterilerde metabolizma dış enzimatik sindirim ile başlar. l Dış ortama salınan enzimler ile dış ortamdaki besin maddeleri parçalanarak hücre zarından geçebilecek küçük maddelere ayrıştırılırlar ve içeri alınırlar. l Endoenzimler hücre içi metabolizmayı yürütürler. l Böylece hücrede yapı taşlarının sentezi, l solunum, l üreme, l hareket ve l diğer yaşamsal işlevler için l gerekli enerji sağlanır.

Bakteri Metabolizması l l Tüm metabolik reaksiyonlarda elektron alışverişi olur. Elektron alışverişi oksidasyon ve redüksiyon olaylarını oluşturur. l Kimyasal reaksiyonda l l oksitlenen madde elektron kaybeder, redüklenen madde elektron kazanır. VE Elektron aktarımı son elektron alıcısına kadar sürer. Solunum oksidasyon ve redüksiyon olaylarının arda sıralanması temeline dayanır.

Bakteri Metabolizması l l Özel solunum enzimleri aracılığı ile oluşan solunum mikroorganizmalarda aerobik ve anaerobik olmak üzere iki temel şekilde olur. Aerobik Solunum: Aerobik solunumda son elektron alıcısı serbest oksijendir, son ürün su, veya hidrojen peroksittir. Aerob bakterilerde bulunan enzimler onlara serbest oksijeni kullanma olanağı sağlar. l l Anaerobik Solunum: Oksijen bu bakterilere toksik etki yapar. Anaerobik solunum sonucunda son elektron alıcısı oksijen dışındaki maddelerdir. Fakültatif anaerobik solunum: Hem oksijenli hem oksijensiz ortamda yaşayıp çoğalabilen mikroorganizmalar

Bakterilerin üremesi için gerekli olan maddeler: Su l l l Bakteri yapısının % 7090’ı sudur. Birçok mikroorganizma suyun az olduğu yerlerde üreyemez, canlı kalamazlar. Hücre dışında bulunan su, suda erimiş maddelerin hücreye taşınmasında rol oynar. l l l Suyun yeterli olmaması durumunda ortamdaki besin maddelerinin, enzim ve metabolitlerin hücredeki alış verişi güçleşir. Su olmayan kuru ortamda birçok bakteri ölmeden metabolik olarak yıllarca inaktif olarak kalabilir. Uygun nem sağlanırsa bu bakteriler tekrar canlanabilirler.

Bakterilerin üremesi için gerekli olan maddeler: Zorunlu (Esansiyel) Elementler l l Tüm mikroorganizmalar karbon dışında hidrojen, oksijen, azot, fosfor ve kükürte gereksinim duyarlar. Bu maddeler karbohidrat, lipit, protein ve nükleik asitlerin yapısına girerler (karbonla birlikte hidrojen ve oksijen birçok organik molekülün yapısını oluşturur). l l Fosfor ATP ve nükleik asitler için Sülfür proteinler için, Azot, nükleik asit ve proteinler için gereklidir. Bu maddeler genellikle bakterinin üremesini sağlayan besiyerinde (kültür vasatı) bulunur.

Bakterilerin üremesi için gerekli olan maddeler l l l Kalsiyum, demir, Vitaminler ve Aminoasitler: potasyum ve manganez l Bazı bakteriler bu gibi mineraller maddeleri hücre içinde bakterilerdeki çeşitli yapı sentezleyemezler. maddelerinin ve enzimlerin yapılarına l Bu nedenle başta anaerop girerler. bakteriler olmak üzere Tüm bakteriler bunların çoğu mikroorganizmayı dışında bazı elementlere üretebilmek için de eser düzeyde ihtiyaç besiyerlerinin içine bu duyarlar (ör. kobalt, maddelerin konması çinko). gerekir. Bu eser elementler kültür ortamı için kullanılan suda çoğunlukla erimiş olarak bulunurlar.

Bakterilerin üremesi için fiziksel gereksinimler: Oksijen 1) Aerob bakteriler: Bu grupta kesin olarak serbest oksijen gereksinimi olan ve bunun yokluğunda beslenme ve üremeleri duran aerob bakteriler bulunur. l l Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphteria 3) Fakültatif anaerob bakteriler: Bu gruptaki bakteriler hem oksijenli ortamda hem de oksijenin bulunmadığı ortamda solunumlarını sağlayacak enzimlere sahiptirler. l l Salmonella spp. , Streptococcus spp. , E. coli l 2) Anaerob bakteriler: Bu grupta solunumlarını tamamen 4) Mikroaerofilik bakteriler: Bu oksijensiz ortamda sağlayan ve grupta sınırlı oksijen bulunması halinde konsantrasyonunda üreyen beslenme ve üremeleri duran (çok az veya çok fazla oksijen bakteriler bulunur. bu bakteriler için toksiktir) bakteriler bulunur, l Clostridium tetani. l l Helicobacter pylori Campylobacter spp.

Bakterilerde solunum tipleri 1: Zorunlu aerop 2: Zorunlu anaerop 3: Fakültatif 4: Mikroaerofil 5: Aerotoleran.

Bakterilerin üremesi için fiziksel gereksinimler : p. H l l l Mikroorganizmaların çoğu nötrofil, yani p. H 6 – 8 aralığında üremeye uymuşlardır. Nadir de olsa, bazı bakteriler asit ortamlarda, bazıları ise bazik ortamlarda daha iyi ürerler. p. H değişikliklerine karşı çok duyarlı olan bazı bakterilerin üretilmesinde besiyerlerine p. H değişmelerini önlemek için tampon maddeler konur. l l Mikroorganizmaların çoğu midedeki düşük p. H derecesinde yaşayamazlar. Midedeki asit ortamı geçebilen bakteriler barsaklara geçerek hastalık yapabilmektedirler.

Bakterilerin üremesi için fiziksel gereksinimler: Karbondioksit l Mikroorganizmaların çoğu havada bulunan oksijen ile yetinirler, ancak bir kısmı için karbondioksit büyük önem taşır, bu bakteriler bulundukları atmosferde % 3 -10 oranında karbondioksit bulunursa daha kolay ve bol gelişirler. l Üremek için yüksek karbondioksit oranına ihtiyaç duyan bakterilere kapnofilik bakteriler adı verilir. Bu bakteriler laboratuvarda içerisinde bir mum yakılan kavanoz içerisinde üretilirler.

Bakterilerin üremesi için fiziksel gereksinimler: Isı l l İçinde yaşadıkları koşullara göre bakteriler bir minimum, bir optimum ve bir maksimum ısı derecesine uymuşlardır. Mikroorganizmalardaki bazı enzimler çeşitli ısı derecelerinde en iyi çalışırlar. Ortalama ısıların altındaki ve üstündeki ısılarda enzim çalışmaları azalır veya durur. Üredikleri sıcaklık derecesine göre bakteriler üç gruba ayrılırlar: 1) Termofil bakteriler: Optimum üreme sıcaklıkları 45 o. C’nin üzeridir. 2) Mezofil bakteriler: İnsanlarda hastalık yapan patojenler bu gruba girerler (+20 o C ile +40 o. C arasında). Bu gruptaki bakteriler daha çok 37 o C’de yaşarlar. 3) Psikrofil bakteriler düşüşk sıcaklıklarda yaşarlar. En iyi 20 o C’nin altında ürerler, bu grup bakterilerin hepsi 0 o C’de üreyebilir.

Bakterilerin üremesi için fiziksel gereksinimler: Osmotik basınç l l l Su molekülleri hücre içerisine osmoz ile rahatça girip çıkabilirler. Eğer çevredeki ortam hücre içine göre daha seyreltik ise su hücre içine l girerek hücre içindeki osmotik basıncı artırır. Mikroorganizmaların çoğu optimal osmotik basınçlı ortamlarda üremeye uymuşlardır. Hücre içi osmotik basıncın dengede olması mikroorganizmaların yaşamlarını devam ettirebilmelerinde oldukça önemlidir.

Bakterilerin üremesi için fiziksel gereksinimler: Osmotik basınç l Bakteriler, peptidoglikan tabaka sayesinde osmotik şok sonucu patlamaktan korunurlar. Bakterilerin bulunduğu ortam düşük osmotik basınca sahipse su molekülleri bakteri hücresini terkederek hücrenin susuz kalmasına neden olur. l Botulismusa yol açan Clostridium botulinum yüksek şeker konsantrasyonunda ölmeden canlılığını sürdürebilmektedir. Bu bakteri bal içerisinde canlı olarak kalabilmekte ve yenidoğan ve süt çocuklarında barsaklarda çoğalıp toksin salgılayarak zehirlenmeye yol açmaktadır.

Mikroorganizmaların enzimleri l Enzimler, l l l protein yapısında, biyokimyasal reaksiyonları katalize eden küçük miktarlarda bulunan v kimyasal tepkime sonrasında harcanmayan organizmanın canlılığını sürdürebilmesi için önemli maddelerdir. l l l Enzimler, düşük molekül ağırlığına sahip organik bir moleküle (koenzim) bağlanmış proteinler (apoenzim) olarak tanımlanabilirler. Her enzimin bir substratı vardır. Her enzim özgül bir kimyasal reaksiyonu katalize eder.

Mikroorganizmaların enzimleri l l Mikroorganizma metabolik aktivitesini sürdürebilmesi için bir değil birden çok enzime (enzim sistemine) ihtiyacı vardır. Bakteri enzimleri etkinlik gösterdikleri yere göre iki grupta incelenebilir: l l Endoenzimler: hücre içinde Ekzoenzimler: hücre dışında görev yaparlar. l l Ekzoenzimler hücre dışında bulunan besinleri hücre içine alınacak hale getirir. Endoenzimler ise bakteri hücresinin yapı taşlarının oluşturulmasında ve hücre için gerekli enerjinin sağlanmasında görev alırlar.

Mikroorganizmaların enzimleri l l Enzimler çok etkin maddelerdir. Bir molekül enzim bir dakika içinde bir milyon substrat molekülünü etkileyebilir. l Enzimler genellikle etkiledikleri maddenin sonuna “ase” (az) konarak adlandırılırlar. l l l hydrolase (hidrolaz = hidroliz yapan), lactase (laktaz = laktozu parçalayan), ürease (üreaz = üreyi parçalayan).

Mikroorganizmaların enzimleri l Bakteri enzimleri, yapı ve uyum enzimleri olarak ikiye ayrılırlar. l Yapı enzimleri: Bakteri hücresinde her zaman, yani sentezlenecek madde olmadan da vardır. Bu enzimler genelde bakterinin yapı taşlarının sentezinde görev alırlar. l Uyum enzimleri: Bir uyarı varlığında oluşan enzimlerdir. Uyarı bittiğinde miktarları çok azalır

Enzimler birbirlerinden çok az farklı 2 kısımdan oluşurlar. 1 -Apoenzim: Protein karakterinde, kolloidal, ısıya dayanıksız, diyalize olmayan ve inaktif bir kısım (polipeptid zinciri veya zincirleri) l 2 -Koenzim (prostetik grup): Bazı enzimler işlevleri sırasında kendilerini aktive eden protein yapıda olmayan organik moleküllere gerek duyarlar. Koenzim ısıya dayanıklı (termostabil), düşük moleküllü ve inaktif organik bir yapı olup substrattan 2 elektronlu hidrojen çekirdeğini alarak onu okside eder.

Enzimler l Bu iki inaktif kısım birleşince aktif enzim (holoenzim) meydana gelir (konjuge enzim). l l Apoenzim + Koenzim Holoenzim (inaktif) (aktif enzim) l Apoenzimler özgül etki göstermelerine karşılık, koenzimler bir çok apoenzime bağlanarak çeşitli kimyasal reaksiyonlara katılabilirler. Koenzimler, apoenzimlere bazen sıkı bazen zayıf bağlarla bağlanmışlardır. Koenzimlerin, enzim aktivitesinde önemleri çok fazladır.

Enzimler l l Kofaktör: Bazı enzimler Enzimlerin etkin bölümünü hücrede sentezlendikleri oluşturan koenzimlerin yapısında zaman genellikle inaktif tiamin, riboflavin, niasin, durumdadırlar (preenzim, pantotenik asit, folik asit, zymogen). Bunlar kofaktör pridoksin gibi vitaminler de veya aktivatör, denen bulunur. maddeler tarafından aktive l tiamin (Vit. B 1), kokarboksilase edilirler. koenziminin l Bu tip enzimler kofaktör l Pantotenik asit, koenzim A (Coolmaksızın etkinlik A)'nın; gösteremezler. l Vit. B 1, flavin adenin dinukleotid l Kofaktörler çoğunlukla Fe++, (FAD)'nin; Mg++, Ce++, Zn++, Cu++‘ gibi l Pridoksal, bazı dekarboksilase metalik iyonlardır. ve transaminase'ların yapısına giren komponentlerdir. l Kofaktörler hücre dışında veya hücre içinde bulunabilir. l C. welchii 'nin theta toksini barsakta trypsin tarafından aktive edilirler.

Kofaktör: l l Trypsinogen, barsakta enterokinase tarafından aktive edilerek trypsin haline (aktif enzim), Pepsinogen midedeki HCl tarafından aktive edilerek (preenzimden, aktiviteyi maskeleyen küçük bir polipeptidin koparılması suretiyle) aktif enzim pepsin haline çevrilir. l l l Bazı enzimlerin aktivasyonu organik olmayan kofaktörler ile olur. Organik fosfatları hidrolize eden fosfatase enzimi, Mg iyonları tarafından aktive edilir. Kalsiyum, genellikle, proteinase’larin kofaktörüdür. Fe, Zn, Mn, Co, Mol ve Cu 'da aynı şekilde görev yapar.

Enzimlerde aktif bölgeler l l l Substratlar, enzimlerin üzerinde kendisine bağlanmak için değiştirilmiş özel konfigürasyona sahip aktif bölge adı verilen özelleşmiş bölgeler ile bağlantı kurarlar. Aktif bölgeler, o kadar güzel şekilde düzenlemişlerdir ki, kendi kimyasal yapılarına uymayan substratları iterler ve onlarla geçici de olsa asla ilişkiye girmezler Aktif yanların bu özelliği, enzimlerin primer yapıları ile ilişkilidir.

Enzimlerde aktif bölgeler Substrat - enzim bağlantısını açıklayan iki teori bulunur 1) Kilit - anahtar teorisi: Substratın, aktif yanlara bağlanması, kısa mesafeden ve kovalent olmayan l iyonik ve hidrojen bağları, l Van der Waals kuvveti gibi kuvvetler ile oluşur 2) Uygunluk teorisi: Kilit - anahtar ilişkisi tarzında belirlenen görüş, bütün enzimatik reaksiyonları açıklayacak kapsama sahip değildir. Uygunluk teorisine göre, substrat, enzimin aktif bölgeleri ile ilişki kurduğunda, enzimin konfigürasyonunda değişiklik meydana gelir ve enzimin üzerinde bulunan katalitik aktiviteye sahip bazı kimyasal gruplar substratla yakın temasa geçerek onu etkisi altına alır.

Enzimlerin aktivitesini etkileyen faktörler 1) Sıcaklık 2) p. H 3) Substrat yoğunluğu 4) Kimyasal maddeler 5) Enzim konsantrasyonu 6) Tuz konsantrasyonu 7) Diğer faktörler l l l 1. Sıcaklık: l Enzimlerin aktivitesi sıcaklık ile direk ilişkili olup, sıcaklık yükseldikçe, enzimin katalize ettiği kimyasal reaksiyonun hızı da artar. Ancak, sıcaklık maksimal veya minimal limitlere yaklaşırsa, enzimin aktivitesinde yavaşlama ve sonunda durma meydana gelir. l l Protein karakterinde olan enzimler yüksek sıcaklıklarda koagule olup çalışamaz hale gelir. Düşük ısı enzim aktivitesini azaltır ve durdurur. Psikrofilik mikroorganizmaların enzimleri 0 -10° C arasında aktif olmasına karşın, insan ve hayvanlarda hastalık oluşturan mikroorganizmaların (mesofilik) enzim aktivitesi, sıcaklık 45°C‘nin üstüne çıkınca azalır. Termofilik mikroplarda enzimler 50 -75 °C' arasında aktivitesini korurlar. Sporlar içindeki enzimler sıcaklık 90 -100 °C' ye çıkınca inaktif duruma gelir.

Enzimlerin aktivitesini etkileyen faktörler 2) p. H: l l l Bakteri türlerine göre değişmek üzere, enzimler belli p. H limitleri (minimal ve maksimal) arasında görevlerini yapabilirler. Ancak, çok asit ve çok alkali ortamlar, enzimlerin çalışması bakımından, genellikle, uygun değildirler. Pepsinin, daha ziyade asit ortamlarda (p. H 1. 9 -2. 0) ve tripsin'in ise alkaliye kaçan ortamlarda (p. H 8. 0) aktivitesi daha iyidir. 3) Substrat konsantrasyonu: l l Ortamda substratın fazla olması ile enzim aktivitesi arasında bir ilişki vardır. Ancak, bu ilişki devamlı değildir. Eğer, enzim konsantrasyonu sabit ise, belli bir limitten sonra substrat yoğunluğunun artmasının bir yararı olmaz.

Enzimlerin aktivitesini etkileyen faktörler 4) Kimyasal maddeler: l l l Ağır metaller (Ag, Hg, Cu, Pb) ve bunların tuzları enzimlerin, sülfidril (-SH) grupları ile birleşerek onların aktivitesini bozarlar. Bu tür etkileyen maddeler arasında deterjanlar, fluorid, borat, quinon, formaldehid, hidrojen peroksit, bazik boyalar, asitler, alkaliler, sodyum azid ve diğer maddeler de vardır. Bunlar genellikle kompetatif olmayan tarzda etkinlik gösterirler. Bazı kimyasal maddeler, normal substrata benzer kimyasal yapıdadırlar ve biyokimyasal reaksiyonlarda, esas substrat yerini alarak enzimle birleşebilirler (kompetatif inhibisyon). l Kompetatif inhibisyonda esas substrat enzimle birleşemediği için reaksiyonlar bozulur. l Örn. suksinik asit ile malonik asit, kimyasal yapı bakımından birbirlerine benzerler ve bu nedenle de enzim, her ikisini birbirinden ayıramaz ve malonik asit, suksinik asit yerine, enzimin spesifik bölgesi ile birleşir.

Enzimlerin aktivitesini etkileyen faktörler 5) Enzim konsantrasyonu: l l Ortamda enzimin fazla veya yeterince olmaması, biyokimyasal reaksiyonların normal gidişinde çok önemli bir faktördür. Enzim yetersizliği hallerinde endergonik ve ekzergonik reaksiyonlarda büyük bozulmalar meydana gelir. 6) Tuz konsantrasyonu: l Ortamda fazla madensel tuzların bulunması enzim aktivitesine olumsuz yönde etkiler. 7) Diğer faktörler: l Ultraviolet ışınları, proteinlere etkileyen diğer fiziksel ve kimyasal faktörler aynı tarzda enzim aktivitesine de olumsuz yönde tesir ederler.

Enzim sentezinin regulasyonu Mikroorganizmalarda enzim sentezinin kontrolü başlıca iki mekanizma tarafından regüle edilir. 1) İndüksiyon (enzim sentezinin uyarılması) 2) Represyon (enzim sentezinin baskılanması). Her nekadar bu iki aktivite birbirine ters gibi görünürlerse de, genellikle, canlıların yaşamında her ikisinin rolü ve etkinliği oldukça önemlidir. İndüksiyon l Ortamda özel indüktörlerin bulunduğu durumlarda enzimlerin sentezi veya salgılanması işlevi meydana gelmektedir. Özellikle, indüklenebilen enzimler l l l beta-galaktosidase, beta galaktoside permease, vb. gibi buna iyi örnek oluştururlar

Enzim sentezinin regülasyonu Represyon l Regulatör bir protein olan represörün ko-represörle birleşerek oluşturduğu aktif kompleksin DNA'da bulunan operatör gen bölgesine bağlanması ve böylece genin fonksiyonu önlenerek m. RNA sentezinin baskılanması sonu enzim sentezinin gerçekleşememesidir.

Enzim sentezinin regülasyonu Represyon başlıca 2 tarzda meydana gelebilmektedir. 1) Son ürün inhibisyonu 2) Katabolik represyon: 1) Son ürün inhibisyonu (Feedback represyonu): l l Birçok bakteri ürediği ortamda metabolik aktivite sonunda bazı son ürünlerin oluşması (amino asitler gibi), enzimin aktivitesini olumsuz yönde etkileyerek, enzim sentezini durdurabilir. Eğer, son ürünler azalır ve minimal düzeye inerlerse etkinlikleri kaybolur ve enzim sentezi tekrar başlar (derepresyon). l Örn. , E. coli, içinde arginin olmayan minimal besiyerinde üretilirse arginin biyosentezi normal olarak yürütülür. Eğer, besiyerine arginin katılırsa enzim (Ornithin Carbomoyl Transferase) sentezi deprese olur. Böyle besiyerinden çıkarılan E. coli 'ler yıkandıktan sonra (argininden kurtarılırsa) minimal ortama ekilirlerse tekrar arginin biyosentezi gerçekleşebilir ve ortamda enzim konsantrasyonu artmaya başlar. Glutamat Ornitin Arginin (son ürün) Citruline

Enzim sentezinin regülasyonu 2) Katabolik represyon: Eğer, E. coli 'ler, içinde hem glikoz ve hem de laktoz (veya, glikoz+sorbitol; glikoz+asetat) bulunan bir besiyerine ekilirse, önce glikoz kullanılır ve laktoz ayrıştırılmaz. İki substrat aynı anda katabolize edilemez ve genellikle, tercihen glikoz metabolize edilir. l Eğer ortamda glikoz ayrışır ve biterse bu defa ikinci substrat kullanılmaya başlar. Burada, ikinci subsratı ayrıştıracak olan enzim ilk aşamada inhibe edilerek sentezi önlenir. Bu tarz inhibisyon "katabolik represyon" olarak tanımlanır.

Bakterilerin üremesi l l Bakteriler belirli bir büyüklüğe ulaşınca ikiye bölünürler (binary fusion) Bir bakteriden iki yeni bakteri oluşumuna kadar geçen süreye ikilenme zamanı denir. Oluşan her yeni bakteriden iki yeni bakteri daha oluşur. Böylece çoğalma sırasında oluşan her yeni bakteri topluluğu bir öncekinin iki katı kadar bakteri içerir. l l Başlangıçta bakteri topluluğu yavaşça çoğalır, ancak bir süre sonra çoğalma patlayıcı bir tarzda olur. Klinikte sık olarak karşılan bakteriyel patojenlerin ikilenme zamanı genelde kısadır, bu nedenle bu bakterilerin laboratuvar tanıları zamanında konabilmektedir.

Mikroorganizmaların üreme hızları ve dönemleri l l l Bakteriler katı besiyerlerinde koloni oluştururlar. Sıvı besiyerlerinde koloni görülmez, bakterilerin üremesi genellikle sıvının bulanıklaşması ile anlaşılır. Sıvı besiyerlerini katılaştırmak için besiyeri içine l l Jelatin Serum Yumurta Agar gibi maddeler katılır. l l Bakteriler sıvı besiyeri ortamına ekildiğinde bir üreme eğrisi elde edilir. Bu eğriye göre üremenin dört fazı vardır. 1) lag fazı, 2) logaritmik faz, 3) durağan faz, 4) ölüm fazı. Bu eğrideki fazların süresi mikroorganizmalar arasında ve farklı çevresel ortamlar arasında farklılık gösterir.

Mikroorganizmaların üreme hızları ve dönemleri l Uygun besiyerine ekilen bir mikroorganizmanın belli bir süre içindeki üreme durumu başlıca 4 evre gösterir. a) Latent dönem, b) Üreme dönemi (logaritmik dönem), c) durağan dönem, d) ölme dönemi

Mikroorganizmaların üreme hızları ve dönemleri 1) Lag Fazı: l l l Bakteriler yeni bir ortama girince önce o ortama adapte olurlar. Metabolik olarak aktif olan ve bölünmeye hazırlanan bakterilerde yeni enzim sentezi olur. Bakterilerin yeni bir ortama girdikten sonra çoğalmaya başlayıncaya kadar geçen süreye lag fazı denir. l l Lag fazında sıvı kültür ortamındaki bakteri sayısında bir artış olmaz. Yeni ortama adapte olamayan bakteri çoğalmaz ancak canlı olarak kalır.

Mikroorganizmaların üreme hızları ve dönemleri 2) Logaritmik Faz: l l Kültürdeki tüm bakterilerin maksimum bir hızla ikiye bölündükleri faza logaritmik faz denir. Bu evrede bakterilerdeki metabolik aktivite çok yoğundur. l l Bu dönemde bakteri cinsinin hacimce en küçük durumundadır. Bu evre, bakterilerin antibiyotiklere karşı en hassas oldukları dönemdir

Mikroorganizmaların üreme hızları ve dönemleri 3) Durağan Faz: l l l Durağan fazda bakteri topluluğunun sayısında bir artış olmaz. Bu evrede ikiye bölünen ve ölen bakteri sayısı birbirine eşittir. Ortamdaki bakteriler sayıca değişmez. Bakterilerdeki metabolik aktivite azalmıştır. 4) Ölüm Fazı: l l Kültür ortamında gelişen olumsuz koşullar sonucunda yaşlanan bakteri hücreleri ölürler. Bu bakteriler yeni bir kültür ortamına aktarılırsa, yeniden çoğalabilirler.

Besiyerleri l l Mikroorganizmaların laboratuvar şartlarında üretilmeleri amacıyla hazırlanan, gelişmeleri ve üremeleri için uygun, gerekli besin maddelerini içeren cansız ortamlara "besiyeri" denir. Bakterilerin büyük çoğunluğu ve mantarlar böyle cansız ortamlarda üretilebilmektedir. l l Bu amaçla steril olarak hazırlanmış olan besiyerleri, dehidrate olmamaları ve denatüre olarak bozulmamaları için buzdolabında saklanır. Bakterileri üretmek amacıyla kullanılan yüzlerce farklı besiyeri mevcuttur, ancak klinik örneklerden bakterileri izole etmek için yüzlerce farklı besiyerine ekim yapmak pratikte mümkün değildir.

Besiyerleri l Öncelikle ekim yapılacak örneğin nereden alındığının, örnekte bulunabilecek bakterilerin ve bu mikroorganizmaların beslenme gereksinimlerinin bilinmesi gerekir. l Adi agar besiyeri çoğu barsak bakterisinin üremesi için uygun bir ortam oluşturur, ancak bazı bakterilerin üretebilmesi için besiyerine zenginleştirici veya inhibe edici bazı maddelerin ilave edilmesi gerekir.

Besiyerlerinin sınıflandırılması İçeriklerine göre l l Bakterileri in-vitro ortamda üretmek için yüzlerce farklı besiyeri mevcuttur. Bunlardan bazıları çok sayıda farklı bakterilerin üremesi için elverişli ortam teşkil ederken, bazıları sadece tek bir tür bakterinin üremesine izin verir. l l Bazıları substratların metabolizması sonucu oluşan p. H değişikliklerini tespit etmek için p. H indikatörleri içerirken, Bazıları bakterilerin kapsül veya spor oluşturmalarını kolaylaştıran maddeler içerir.

Besiyerlerinin sınıflandırılması İçeriklerine göre 1) Sentetik besiyerleri l Belirli miktarlarda saf kimyasal maddeler kullanılarak hazırlanan, yapısı ve içeriği tam olarak bilinen besiyerlerine "kimyasal olarak tanımlanmış" veya “sentetik” besiyerleri denir. l Bu tür besiyerleri genellikle, besiyerine belirli kimyasal maddeleri ilave etmek veya çıkartmak suretiyle, bir bakterinin esansiyel ihtiyaçlarını belirlemek, bakterilerin metabolizmalarını incelemek ve biyolojik ürünlerini saf olarak elde etmek amacıyla kullanılır.

Besiyerlerinin sınıflandırılması İçeriklerine göre 2. Semisentetik besiyerleri: l Belirli oranlarda kimyasal maddeler ile miktarı belli olmayan çeşitli organik maddeler içerir, bu nedenle bu besiyerlerinin de içeriği tam olarak tanımlanmamıştır. 3. Non-sentetik besiyerleri: l İçinde miktarı belli olmayan çeşitli organik maddeler bulunur, bu grupta yer alan besiyerlerinin içeriği tam olarak belli değildir

Besiyerlerinin sınıflandırılması Genel üretim besiyerleri: l l Rutin mikrobiyoloji laboratuvarlarında bakterileri üretmek için, doğal ürünlerden yararlanılarak hazırlanan "genel üretim besiyerleri" (ampirik besiyerleri) kullanılır. Besiyerlerine şekerler, aminoasidler, vitaminler ve tuzlar içeren kompleks doğal ürünler ve kimyasal maddeler l l l et suyu, et ekstraktı, pepton (pepsin, tripsin, papain gibi enzimlerle kısmen parçalanmış proteinler), maya ekstraktı, kan, serum, süt verilebilir. ilave edilir. l l Bütün bunlar çeşitli Bu tür besiyerleri doğal ürünlerden hazırlanmış çok sayıda kompleks organik maddeler içerdiğinden dolayı, kimyasal içerikleri kesin olarak tanımlanmamıştır. Besiyerlerine ilave edilen bu doğal ürünler çok sayıda bakterinin üremesini stimüle eder. İnsanlar için patojen olan veya normal florada bulunan bakterilerin çoğu bu tür besiyerlerinde üreyebilir.

Besiyerlerinin sınıflandırılması Genel üretim besiyerleri: A) Temel Besiyerleri: B) Zenginleştirilmiş besiyerleri: Birçok bakterinin üremesine olanak veren l Temel besiyerleri kan, serum, haben sıvısı, besiyerleridir. yumurta gibi besleyici l Peptonlu su: Tuz, su ve maddeler ilave edilerek pepton zenginleştirilebilir. l Buyyon: etsuyu, pepton l Temel besiyerlerinde ve tuz üremeyen bazı l Adi agar: buyyon içine bakterilerin üretilmesi agar ilave edilmesi ile amacıyla kulanılır. hazırlanan besiyeri

Besiyerlerinin sınıflandırılması Özel amaçlı besiyerleri 1) Selektif besiyerleri: 2) Ayırt edici besiyerleri: Belirli türdeki bir bakterinin üremesini kolaylaştırırken istenmeyen türlerin üremesini baskılayan besiyerleridir. l l Bu tür besiyerleri, özellikle karışık bir floraya sahip dışkı, tükürük, abse, eksuda gibi klinik örneklerden bulunan az sayıdaki patojen bakterinin izolasyonu için kullanılır. l Çeşitli bakterilerin ayırt edici özelliklerini incelemek amacıyla kullanılırlar. En yaygın kullanılan ayırt edici besiyerlerinden birisi olan kanlı agar, birçok bakteri için uygun üreme ortamı oluşturur.

Seçici besiyeri Sodium thiosulfate, Ferric ammonium citrate ve Sodium deoxycholate ile zenginleştirilmiş Xylose Lysine (XL) agar besiyerinde Salmonella sp. 24 saatlik kültürü

Seçici besiyerleri (Salmonella ve Shigella spp. )

Besiyerlerinin sınıflandırılması Özel amaçlı besiyerleri 3) Selektif ve ayırt edici besiyerleri: l l Bazı besiyerleri hem selektif hemde ayırt edici özellik taşıyabilir. Bakterilerin idantifikasyonu amacıyla, biyokimyasal özelliklerini incelemek için kullanılan besiyerleri ayırt edici veya selektif / ayırt edici özellik taşır. 4) Zenginleştirici besiyerleri: l l Çok sayıda farklı mikroorganizma bulunan bir ortamda, izole edilmesi arzulanan bakteri çok az sayıda bulunuyorsa zenginleştirici besiyerleri kullanılır. Bu besiyerleri, izolasyonu istenen bakterinin çoğalmasını kolaylaştıran maddeler içerir.

Besiyerlerinin sınıflandırılması Özel amaçlı besiyerleri 5) Anaerob bakterilerin üretilmesinde kullanılan besiyerleri: l l Anaerob bakteriler uzun süre agar içeren büyük deney tüplerinde, atmosferik oksijenin ulaşamadığı dip kısımlarda üretilmiştir. Daha sonraları, ortamdaki oksijeni gideren redükleyici maddeler ilave etmek suretiyle, anaerob bakterilerin daha kolay üremesini sağlayan besiyerleri hazırlanmıştır. l l Anaerob bakterileri üretmek amacıyla hazırlanan besiyerlerinde en sık kullanılan redükleyici maddelerden birisi sodyum tioglikolat'tır. Sodyum tioglikolat, besiyerlerinde çözünmüş olarak bulunan oksijen ile kimyasal reaksiyona girerek mikroorganizmalar tarafından kullanılmasını engeller.

Besiyerlerinin sınıflandırılması Fiziksel özelliklerine göre 1) Katı besiyerleri 2) Sıvı besiyerleri 3) Yarı-katı besiyerleri l l Sıvı besiyerini katılaştırmak için laboratuarda değişik maddeler kullanılır. Mikrobiyolojide bu amaçla en sık kullanılan madde deniz yosunlarından elde edilen ve kompleks bir polisakkarid olan “agar” kullanır. l l Katı besiyeri elde etmek için sıvı besiyerlerine % 1. 5 -2. 0 oranında (w/v) agar ilave edilir. Agar, 100°C’de şeffaf bir eriyik halindeyken, yaklaşık 4042°C’de katılaşır (37°C’de katı halde olması önemlidir) Çoğu mikroorganizma için besin değeri taşımaz, mikroorganizmaların üremesi sırasında metabolize olmaz ve ortamın p. H değerini değiştirmez. Bütün bu özelliklerinden dolayı agar, besiyerlerinin katılaştırılmasında kullanılan ideal bir maddedir.

Besiyerlerinin sınıflandırılması Fiziksel özelliklerine göre l Bol miktarda proteinli maddeler içeren bazı besiyerleri ise, koagülatörde veya otoklavda yüksek ısılara maruz bırakılarak, proteinlerin pıhtılaşması sağlanmak suretiyle katılaştırılır l l Mycobacterium tuberculosis kültürü için kullanılan ve yumurta içeren Löwenstein-Jensen besiyeri Corynebacterium diphtheriae kültürü için kullanılan ve sığır ya da at serumu içeren Loeffler besiyeri l Bunlardan başka, sıvı besiyerlerine % 0. 3 -0. 5 oranında agar ilave edilerek yarı-katı besiyerleri de hazırlanabilir. l Craigie besiyeri, bakterilerin hareket muayenesi için kullanılan ve % 0. 4 oranında agar içeren yarı-katı bir besiyeridir

Mikrobiyoloji laboratuvarlarında sık kullanılan bazı besiyerleri Peptonlu su: l l Pepton, çeşitli proteinlerin pepsin, tripsin, papain gibi enzimlerle kısmen parçalanması sonucu elde edilir. Bakteriler tarafından nitrojen kaynağı olarak kullanılır. l Peptonlu su, distile su içerisine % 1 (w/v) oranında pepton ve % 0. 5 (w/v) oranında Na. Cl ilave edildikten sonra otoklavda sterilize etmek suretiyle hazırlanır.

Mikrobiyoloji laboratuvarlarında sık kullanılan bazı besiyerleri Et suyu ve Buyyon Et suyu : l l Bakteriler için oldukça zengin ve besleyici bir ortamdır. İki kez çekilmiş yağsız ve sinirsiz sığır kıymasının iki misli (w/v) çeşme suyu ile, zaman karıştırılarak 30 dakika kadar kaynatılması ve filtre kağıdından geçirilmesi suretiyle hazırlanır. Buyyon: l Etsuyuna % 1 oranında pepton ve % 0. 5 oranında Na. Cl ilave edilip otoklavda sterilize edilir. Besiyerinde çökmüş olabilecek fosfatları gidermek amacıyla tekrar filtre kağıdından süzülür, uygun kaplara uygun miktarlarda dağıtılır ve yeniden otoklavlanır.

Mikrobiyoloji laboratuvarlarında sık kullanılan bazı besiyerleri Adi agar (jeloz): l l l Buyyon içerine % 1. 5 - 2. 0 oranında agar ilave edilerek hazırlanır. Besiyeri ilk önce 100°C civarındaki su banyosunda bekletilerek agarın tamamen erimesi sağlanır, sonra otoklavda sterilize edilir. Sterilizasyondan sonra steril tüplere veya petri kutularına dağıtılarak dondurulur l l tüp içerisinde yatık olarak donurulursa yatık jeloz, dik olarak dondurulursa dik jeloz denir

Mikrobiyoloji laboratuvarlarında sık kullanılan bazı besiyerleri Kanlı agar: l l l Adi agar, sterilizasyon işleminden sonra su banyosunda bekletilerek 45 -50°C'ye kadar soğutulur. İçerisine % 5 - 7 (v/v) oranında, steril şartlarda alınıp, defibrine edilmiş koyun kanı (steril cam boncuklu şişede) ilave edilip, karıştırılır ve steril tüplere veya petri kutularına dağıtılır. Kan, besiyerinin ısısı 50°C'nin üzerinde iken ilave edilirse eritrositler parçalanır ve çukulata agar besiyeri elde edilir.

Besiyerlerinde p. H ayarlaması l l l Besiyerlerinin p. H'ını, mikroorganizmaların üreyebileceği uygun değerlere ayarlamak gerekir. p. H ayarlaması sterilizasyon işleminden önce yapılmalı, sterilizasyondan sonra kontrol edilmelidir. Besiyerlerini katılaştırmak için kullanılan agarın p. H'ı etkilememesi gerekir. Bu durumda agar, p. H ayarlanmadan önce ilave edilir. l l Besiyerlerinin p. H'ını ölçmek için p. H indikatörleri emdirilmiş p. H kağıtları, indikatör solüsyonlar veya elektronik p. H-metreler kullanılabilir. Besiyerlerinin p. H'ını ayarlamak için genellikle seyreltik Na. OH ve HCl çözeltileri kullanılır.

Besiyerilerine ekim Mikroorganizmaların çeşitli özelliklerinin incelenmesi, tek koloni veya saf kültür halinde elde edilmelerine bağlıdır. Ekim: Pasaj: Klinik örnekteki Besiyerinde üremiş bir mikroorganizmaları mikroorganizmayı daha fazla (bakteri, mantar, vb) çoğaltmak, saf kültür halinde üretmek veya örnekte elde etmek, üreme ve mikroorganizma biyokimyasal özellikleri ile bulunup bulunmadığını antibiyotiklere duyarlılık araştırmak amacıyla, durumlarını incelemek hastadan alınan amacıyla bir besiyerinde materyalin özel aletler kullanılarak uygun üremiş olan besiyerlerine mikroorganizmanın başka aktarılması işlemine besiyerlerine aktarılması denir. işlemine denir.

Besiyerilerine ekim • Öze: Klinik örneğin besiyeri üzerine tek koloni düşecek şekilde yayılması veya besiyerinde üreyen bakterinin başka bir besiyerlerine aktarılmasında kullanılan paslanmaz metalden bir sap ve bu sapın ucunda telden oluşan alettir. • Kullanım amacına göre telin uç kısmı iğne şeklinde (iğne öze) veya halka şeklinde (halka öze) olabilir.

Besiyerilerine ekim l l l Çabuk ısınması ve soğuması nedeniyle alevde kolayca sterilize edilebilen, platin özeler tercih edilir. Ayrıca plastikten imal edilmiş tek kullanımlık özeler de mevcuttur. Bazı halka özeler kalibrelidir ve belirli miktarda sıvı tutarlar. Bu tip özeler, özellikle idrar gibi sıvı materyallerden kantitatif kültür yapmak amacıyla kullanılır. l l Ekim, petri kutusunda katı bir besiyerine yapılacaksa halka öze, tüp içerisinde dik veya yatık bir besiyerine yapılacaksa iğne öze tercih edilir. Hareket muayenesi için kullanılan Craigie besiyeri veya bakterilerin aerob ve anaerob ortamlarda üreme özelliklerini incelemek için kullanılan V-F dik jeloz gibi özel amaçlı besiyerlerine ekim yapılırken de iğne öze kullanılır.

Besiyerilerine ekim l Hastalardan alınan örnekler sıvı (idrar, kan, beyin omurilik sıvısı, çeşitli ponksiyon sıvıları, vb. ), visköz (tükürük, balgam, irin, vb. ) veya katı (doku örnekleri, biyopsi materyalleri, vb. ) olabilir. Örnekler ayrıca bir eküvyon yardımıyla, sürüntü şeklinde de (boğaz, burun, göz, genital bölge, abse, yara, vb. ) alınabilir. l Örnekler eküvyon ile alınmışsa ilk ekimler genellikle direkt olarak bu eküvyon ile yapılır. Örnek sıvı besiyerine ekilecekse, eküvyon besiyerine daldırılır, materyalin besiyeri içerisine yeteri kadar geçmesi için tüpün kenarına bastırılır ve çalkalanır. Katı besiyerine ekilecekse eküvyon, besiyerinin belirli bir bölgesine döndürülerek sürülür ve öze yardımıyla tek koloni düşürülür

Eküvyon ile ekim ve öze yardımıyla tek koloni düşürme yöntemi a) Eküvyon ile alınan materyal, eküvyonu besiyeri yüzeyinde belirli bir bölgeye döndürerek sürmek suretiyle ekilir b) Alevde sterilize edilmiş ve soğutulmuş bir halka öze ile, ilk ekim bölgesinden başlayarak besiyeri yüzeyinde zikzaklar çizilir. Aynı işlem, öze her defasında sterilize edilerek ikinci ve üçüncü ekim bölgelerinde tekrarlanır c) İnkübasyondan sonra besiyeri yüzeyinde ayrı olarak gelişen koloniler değerlendirilir.

Besiyerilerine ekim l l Ekilecek materyal sıvı ise, ekim işlemi öze, pipet veya eküvyon yardımıyla yapılabilir. Kalitatif değerlendirme için materyal duruma göre sıvı bir besiyerine inoküle edilebilir, katı bir besiyerine damlatılıp besiyeri yüzeyine yayılması sağlanabilir, yada katı besiyerinin belirli bir bölgesine ekilerek tek koloni düşürülebilir. l Kantitatif değerlendirme yapılacaksa, materyal dereceli pipet veya kalibreli öze yardımıyla besiyeri yüzeyine belirli miktarda ekilir (yoğun mikroorganizma içeren sıvı materyallerin, ekim yapılmadan önce belirli oranlarda sulandırılması gerekebilir), besiyeri yüzeyine yayılır ve inkübasyon süresi sonunda oluşan koloniler sayılarak mililitredeki CFU (koloni oluşturan birim) hesaplanır.

Sıvı materyallerin kantitatif olarak ekilmesi a) İdrar gibi klinik materyallerde mililitredeki mikroorganizma sayısını tespit etmek için, belirli miktarda materyal (gerekirse sulandırılarak) besiyerine ekilir. Sık kullanılan yöntem, kalibreli öze ile besiyerinin çapı boyunca bir çizgi ekimi yapmak ve aynı öze ile, alevden geçirmeksizin, ilk ekim çizgisine dik zig-zak’lar çizmektir. Amaç, materyalin besiyeri yüzeyine dağılmasını sağlayarak seyreltmek ve kolonileri ayrı elde etmektir. b) İnkübasyondan sonra besiyeri yüzeyinde gelişen koloniler sayılarak mililitredeki mikroorganizma sayısı hesaplanır

Besiyerlerinde bakterilerin üretilmesi l l Mikroorganizmaları laboratuvarlar şartlarında üretebilmek için optimal fiziksel şartların sağlanması gereklidir. Bu amaçla l l Farklı besiyerleri inkübasyon ısısı, inkübasyon süresi, atmosfer özellikler değiştirilerek belirli mikroorganizmaların üremesi için daha elverişli ortamlar hazırlanabilir. l l Ekim yapıldıktan sonra besiyerleri, bakterilerin üremesi ve çoğalması amacıyla inkübatör (etüv) adı verilen cihazlarda belirli süre bekletilir. İnkübasyon süresi, bakterinin özelliklerine göre değişebilir.

Bakteri kolonileri S koloni: Yuvarlak, düzgün kenarlı, düzgün yüzeyli, nemli ve homojen görünümlü kolonilerdir. İngilizce “smooth” = düzgün kelimesinden türetilmiştir. En yaygın görülen koloni tipidir. R koloni: Kenarları girintili çıkıntılı, yüzeyleri buruşuk veya tanecikli, genellikle basık görünümlü kolonilerdir (İngilizce “rough” = pürüzlü kelimesinden türetilmiştir). Mycobacterium tuberculosis ve Corynebacterium diphtheriae gibi bakteriler doğal olarak R koloniler oluştururken, normalde S koloni oluşturan bakteriler de, eskimiş kültürlerde veya uygun olmayan koşullarda üretilmeleri sonucunda R koloni oluşturabilir.

Bakteri kolonileri Bomba koloni: Bazı bakterilerin (örneğin Shigella sonnei) oluşturdukları S kolonisinin bir tarafında, R koloni tipinde bir koloni uzantısı görülür (patlamış bombaya benzetildiğinden dolayı bomba koloni adı verilmiştir). M koloni (mukoid koloni): Parlak, sümüksü görünümlü, yapışkan ve visköz özellikte kolonilerdir. Kapsüllü bakterilerin oluşturdukları tipik koloni şeklidir.

Bakteri kolonileri L koloni: L-form bakterilerin özel besiyerlerinde oluşturdukları çok küçük kolonilerdir. Koloni besiyerinin içerisine doğru girer. Mycoplasma cinsi içerisinde yer alan türler özel besiyerlerinde üretildiklerinde çok küçük, yüzeyleri granüllü, ortaları daha koyu görünen (sahanda yumurta görünümü), besiyeri içerisine doğru uzanmış koloniler oluştururlar. Ureaplasma türleri ise yine çok küçük ve besiyeri içerisine uzanan koloniler oluştururlar

Koloni morfolojisi

Koloni morfolojisi Lowenstein- Jensen besiyeri

Hemoliz l l l Bazı bakteriler eritrositleri parçalayan hemolizin adı verilen enzimler oluştururlar. Hemolizine sahip bakterilerin, kanlı agarda oluşturduğu kolonlerin etrafı halka şeklinde hemoliz zonu ile çevrilidir. Üç türlü hemoliz vardır. l l l Alfa (α) hemoliz Beta (β) hemoliz Gamma (γ) hemoliz (hemolizsiz) l l Mikroorganizmaların tanımlanmasında bakterinin hemolizin enzimine sahip olup olmadığının tespit edilmesi önemli bir özellikdir. Kanlı agar besiyeri hemolitik bakteriler ile non-hemolitik bakterilerin ayrımına olanak sağlayan ayırt ettirici bir besiyeridir.

Hemoliz l Beta hemoliz: koloni etrafındaki eritrositler tamamen parçalanması ile oluşan tam hemolizdir. Koloninin etrafında tamamen şeffaf bir halka şeklinde görülür. l Alfa hemoliz: eritrositler tam olarak parçalanmamıştır. Koloninin etrafında yeşilimsi sarı renkli, tam şeffaf olmayan bir halka şeklinde görülür.

Hemoliz tipleri

Hemoliz

Kan kültürü Hemokültür l l l Kan, normal şartlarda sağlıklı insanlarda sterildir. Çeşitli infeksiyon hastalıklarının seyri esnasında patojen mikroorganizmalar kanda bulunabilir. Bakteriyemi: bakterilerin kan dolaşımında bulunması Viremi: virusların kan dolaşımında bulunması Fungemi: mantarların kan dolaşımında bulunması l l l Kanın bakteriyolojik kültürü için genellikle Castaneda’nın difazik kan kültürü besiyeri kullanılır. Bu besiyeri, hem katı hemde sıvı besiyerinin aynı şişede birarada kullanıldığı bir ortamdır. Ekilecek kan miktarı, sıvı besiyerinin yaklaşık 1/10’u kadar olmalıdır.

Besiyerlerinde bakterilerin üreme özellikleri l l l Buyyon veya peptonlu su gibi sıvı besiyerlerinde üreyen bakteriler besiyerinde homojen bir bulanıklık, dipte çöküntü, yüzeyde zar oluşturabilir veya besiyerini pıhtılaştırabilirler. Katı besiyerlerinde üreyenler ise besiyerinde "koloni" adı verilen gözle görülür kümeler oluştururlar. Koloni, tek bir mikroorganizmanın katı besiyerinde üreyip çoğalması sonucu meydana gelen oluşumlardır. l l l Bir kolonide bulunan tüm bakteriler aynı atadan köken alır ve aynı özellikleri taşırlar. Bakteri kolonilerinin görünümleri ve özellikleri türden türe (hatta aynı tür içerisinde yer alan bakteriler arasında bile) farklılıklar gösterebilir. Koloni morfolojisi l l l şekli, büyüklüğü, kanlı agar besiyerinde hemoliz özelliği bakteri ve mantarların tanımlanmasında önemli ip uçları verir.

İdentifikasyon (İzole edilen bakterinin tanımlaması) Biyokimyasal testler ve besiyerleri İzole edilen herhangi bir bakteri l optimal üreme şartları, l izolman besiyerinin özelliği l koloni morfolojisi, l boyanma ve mikroskopik özellikleri l sahip olduğu enzim sistemlerinin tespit edilmesi ile tür ve cins düzeyinde adlandırılabilir. l Bakterinin enzim sistemleri biyokimyasal testler ve identifikasyon besiyerleri yardımı ile incelenebilir.

İdentifikasyon Gram boyanma özelliği Gram pozitif basil Gram negatif basil

İdentifikasyon Gram boyanma özelliği Gram pozitif kok Gram negatif kok

İdentifikasyon Gram negatif boyanan pleomorfik bakteriler

İdentifikasyon Saf kültür l l l İzole edilen bir bakterinin tanımlanmasında tek koloni temel alınır. Ancak tek bir koloni çok sayıda biyokimyasal testin yapılmasına yetmez. Bu nedenle saf kültür yapılır. Saf kültür: Bir tek koloniden çok sayıda koloni elde etmek veya bir başka deyiş ile bir tek bakteriden köken alan aynı türdeki bakteri topluluğudur. Klinik örnekten saf kültür elde etmek için, l İlk önce örnekten uygun katı besiyerine tek koloni düşürülür. l l Tek tek duran bakteriler inkübasyon süresi boyunca bölünerek çoğalır ve koloni oluştururlar. Değişik amaçlarla saf kültürü yapılmak istenen koloni alınarak uygun sıvı veya katı besiyerine pasajlanır. Eğer pasaj katı ortama yapıldı ise tek koloni düşürme yöntemi ile koloni besiyeri yüzeyine yayılır. Ekim yapılan plak etüve kaldırılıp uygun ısı ve sürede inkübe edilir

İdentifikasyon (İzole edilen bakterinin tanımlaması) l l Bakterilerin tanımlanmasında birçok biyokimyasal reaksiyondan yararlanılır. Bu amaçla kullanılan biyokimyasal testlerin birçoğunda testin sonucu, oluşan renk değişikliği ile değerlendirilir. Besiyerinde renk değişikliğini sağlayan indikatörler (ayıraçlar)'dir. İndikatörler, ortam şartlarındaki değişikliklere bağlı olarak renk değiştiren maddelerdir. l p. H indikatörleri, ortamdaki p. H değişikliklerine göre renk değiştirirler.

İdentifikasyon İndol testi

İdentifikasyon Metil kırmızısı testi

İdentifikasyon Urease Hareket

İdentifikasyon TSI besiyeri l l l Laktoz Glukoz Sukroz H 2 S yapma Gaz oluşturma

İdentifikasyon Tek şeker besiyeri l l Asit oluşturma Gaz oluşturma

Antibakteriyel Duyarlılık Testleri l l l Klinik örneklerden infeksiyon etkenini izole etmek, uygun tedavinin seçimi için her zaman yeterli olmaz. Birçok bakteri antibakteriyel ajanlara karşı direnç göstermektedir ve bu durum bakteriyel infeksiyonların tedavisini güçleştirmektedir. Antibakteriyel duyarlılık testleri (antibiyogram), izole edilen bir patojen bakterinin çeşitli antibakteriyel ajanlara karşı duyarlılığını incelemek için yapılır ve bakteriyel infeksiyonların tedavisinde yol gösterici olarak büyük önem taşır. Disk difüzyon yöntemi

Antibakteriyel Duyarlılık Testleri Disk difüzyon yöntemi l l Bakterilerin antibakteriyellere karşı duyarlılık-dirençlilik paternlerini araştırmak için pratik uygulamada en yaygın kullanılan yöntemdir. Taze bakteri kültüründen antibiyogramı yapılacak bakterinin steril fizyolojik tuzlu su içerisindeki oranı 105 bakteri / ml olacak şekilde süspansiyonu hazırlanır. l l Bu süspansiyon steril bir eküvyon veya L şeklindeki cam baget yardımı ile Mueller-Hinton agar besiyerinin yüzeyine homojen olarak yayılır Her birinde standart miktarda antibiyotik bulunan diskler besiyerinin yüzeyine belirli aralıklarla yerleştirilir ve plaklar oda sıcaklığında 20 -30 dakika bekletilir.

Antibakteriyel Duyarlılık Testleri Disk difüzyon yöntemi l l Disklere emdirilmiş haldeki antibiyotikler agar içerisine, gittikçe azalan miktarlarda diffüze olur. Plaklarb etüv kaldırılıp, 1824 saat inkübe edilir. Bakteri, o antibiyotiğe duyarlı ise diskin etrafında, üremenin olmadığı bir inhibisyon zonu oluşur. Bakterinin duyarlılığı ile inhibisyon zonunun çapı direkt olarak ilişkilidir. l l l İnhibisyon zonunun çapı ölçülür. İnhibisyon zon çapı daha önceden her antibiyotik için belirlenmiş standart değerler ile karşılaştırılıp karar verilir. Disk etrafında inhibisyon zonunun görülmemesi veya zon çapının standart değerlerin altında ölçülmesi bakterinin o antibakteriyele karşı dirençli olduğunu gösterir.

Antibakteriyel Duyarlılık Testleri Disk difüzyon yöntemi A B C Üreme alanı İnhibisyon alanı yok (Bu antibiyotiğe dirençli) İnhibisyon zonu (Bu antibiyotiğe duyarlı) A) Antibakteriyel duyarlılık paterni incelenecek bakterinin steril fizyolojik tuzlu su içerisinde, 105 bakteri/ml olacak şekilde süspansiyonu hazırlanır ve Mueller-Hinton agar besiyerinin yüzeyine homojen olarak yayılır B) Diskler besiyerinin yüzeyine belirli aralıklarla yerleştirilir ve inkübasyona bırakılır. C) 18 -24 saatlik inkübasyonu takiben, oluşan inhibisyon zonu değerlendirilir. İnhibisyon zonu oluşmaması, bakterinin o antibiyotiğe dirençli olduğunu gösterir

Antibakteriyel Duyarlılık Testleri E - test