MKROORGANZMALARIN RETLD ORTAMLAR 1 Mikroorganizmalarn izolasyonu ve identifikasyonu

MİKROORGANİZMALARIN ÜRETİLDİĞİ ORTAMLAR 1

® Mikroorganizmaların izolasyonu ve identifikasyonu amacıyla zaman içinde birçok ortamlar geliştirilmiş ve bunların büyük bir kısmı başarı ile kullanılmıştır. ® Mikroorganizmaların ilk keşfedildiği zamanlarda bu amaçla kuru ot infüzyonu, kan, süt, sebze ve meyve suları kullanılmış ve bazı mikroorganizmalar üretilebilmiştir. ® Daha sonra hayvansal dokulardan infüzyonlar hazırlanmış ve bunların üretme kabiliyetlerinin daha iyi olduğu anlaşılmıştır. ® Ayrıca içlerinde yeterince organik ve inorganik madde bulunan ve çeşitli üretme faktörlerini içeren daha komplike ortamlar da hazırlanmıştır. 2

®İnsan ve hayvanlarda hastalık oluşturan mikroorganizmaların izolasyon ve identifikasyonu ®ve üretilmesi için kullanılan ortamlar başlıca 2 ana bölüme ayrılırlar: ®A. CANLI ORTAMLAR ®B. CANSIZ ORTAMLAR 3

A. CANLI ORTAMLAR I. Doku (Hücre) kültürü II. Embriyolu yumurtalar III. Deneme hayvanları a. Konvansiyonel hayvanlar b. Spesifik Patojen Free (SPF) hayvanlar c. Germ free (Mikropsuz) hayvanlar 4

B. CANSIZ ORTAMLAR I. Genel besi yerleri II. Özel besi yerleri a. Selektif besi yerleri b. Diferansiyel besi yerleri c. Zenginleştirilmiş besi yeri d. Biyokimyasal özelliklerin tespiti için kullanılan besi yerleri e. Özel amaçlar için hazırlanan besi yerleri f. Sentetik besi yerleri 5

® A. CANLI ORTAMLAR ® Hastalık oluşturan riketsia, klamidia ve viruslar gibi bazı etkenler ancak canlı hücrelerin bulunduğu ortamlarda üreyebilirler. ® Bunlar cansız ortamlarda gelişemez ve üreyemezler. ® Söz konusu mikroorganizmaların izolasyonu, identifikasyonu ve bazı özelliklerinin tespiti amacıyla günümüzde de kullanılan bu ortamlar 3 grupta incelenebilir: ® 1. DOKU (HÜCRE) KÜLTÜRÜ ® 2. EMBRİYOLU YUMURTALAR ® 3. DENEME HAYVANLARI 6

1. DOKU (HÜCRE) KÜLTÜRÜ İnsan ve hayvanların çeşitli organ veya dokularından hazırlanan ve in vitro olarak üretilen hücrelerdir. Genellikle virusları, riketsiya ve klamidiya etkenlerini izole ve identifiye etmede, çeşitli serolojik ve diğer bazı testleri uygulamada yaygın olarak kullanılırlar. Örnek: l Primer kültürler l Devamlı kültürler l Cell-line hücreler 7

2. EMBRİYOLU YUMURTALAR Embriyolu yumurtalar (tavuk, ördek v. s. ), canlı embriyo ihtiva etmeleri nedeniyle bu ortamlarda daha iyi üreyebilen etkenler yönünden doku kültürlerine tercih edilirler. Viral ve bakteriyel hastalıkların teşhisi, antijen hazırlanması, viral aşıların hazırlanması ve kimyasal maddelerin mikroorganizmalara etkilerinin kontrollerinde kullanılırlar. Bu ortamlarda yapılan işlemlerin güvenilir sonuçlar verebilmesi için Spesifik Patojen Free (SPF) hayvanlardan elde edilen yumurtaların kullanılması gerekir. 8

3. DENEME HAYVANLARI Örnek: Fare Hamster Tavuk Rat Köpek Güvercin Kobay Kedi Kurbağa Tavşan Koyun Kaplumbağa Domuz Maymun 9

a. Konvansiyonel Hayvanlar Laboratuvar veya enstitülerde kendine yetişen, üreyen ve herhangi bir sağlık kontrolünden geçirilmeyen hayvanlardır. Bu hayvanlara sadece yem ve su vermekten başka herhangi bir özel bakım ve besleme uygulanmaz. Bu hayvanlar her türlü patojenik ve apatojenik etkeni bulundurabilir. Kanlarında çok çeşitli etenlere karşı antikor bulunabilir. Böyle hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalar güvenilir sonuç vermez ve yanıltıcı olabilir. 10

b. Spesifik Patojen Free (SPF) Hayvanlar Bu hayvanların sistemlerinde çeşitli mikroorganizmalar bulunur ancak bazı önemli patojenik etkenler (Tüberküloz, Brusella, Antraks, Listeria v. s. ) bulunmaz. Bu hayvanların yetiştirilmesi daha uygun hijyenik şartlarda gerçekleştirilir. Verilen gıdalar ve suyun mikrobiyolojik kontrolleri yapılır. Hava, filtrelerden süzülerek içeri alınır. Sertifikalı hayvanlardır ve güvenle kullanılabilir. 11

c. Germ Free (Mikropsuz) Hayvanlar Sistemlerinde herhangi bir mikroorganizma bulundurmadıkları gibi kanlarında da antikor bulunmaz. Germ Free hayvanlar sezaryan operasyonu ile alınırlar ve özel plastik veya madeni üniteler içinde steril koşullar altında üretilirler. Bu hayvanlara verilen gıda ve su sterilize edilir. Solunum havası özel filtrasyon sistemlerinden geçirilerek kesinlikle herhangi bir mikroorganizma ile karşılaşmamaları sağlanır. Böyle hayvanlar üzerinde yapılacak çalışmaların güvenilirliği oldukça yüksektir. Ancak böyle hayvanları yetiştirmek son derece masraflıdır. 12

B. CANSIZ ORTAMLAR (BESİ YERLERİ) Bu ortamlar, yapılan araştırmalar sonucu geliştirilen ve bakterilerin izolasyon ve identifikasyonlarında kullanılan besi yerleridir. Sıvı (Buyyon/Broth), katı (Agar) ya da yarı katı formlarda hazırlanabilen ve değişik özelliklere sahip olan çeşitleri vardır. Besi yerleri, mikroorganizmaların genel gıda gereksinimleri göz önünde tutularak hazırlanır. 13

B. CANSIZ ORTAMLAR (BESİ YERLERİ) Bazı mikroorganizmalar çok basit ortamlarda üreyebildikleri halde (prototrof), bir kısmının gelişebilmesi ve üreyebilmesi için ortamda üretme faktörlerinin, organik veya inorganik bazı ilave maddelerin bulunması gereklidir (okzotrof). Besi yerleri, kullanım amaçları ve bileşimlerine göre; 2 ana gruba ayrılırlar: 1 - Genel Besi yerleri 2 - Özel Besi yerleri 14

1. GENEL BESİ YERLERİ Bileşimine giren maddeler kolay bulunur ve ucuzdur. Kısa bir süre içinde hazırlanır ve laboratuvarlarda yaygın olarak izolasyon, pasajlama veya bazı karakterlerin tespiti amacıyla kullanılırlar. Genel besi yerleri sıvı ya da katı olabilir. Mikroorganizmaları yeterince üretebilecek protein, karbon, enerji kaynakları ve diğer faktörlere sahiptirler. Kullanma amacına göre ilave olarak bileşimlerine kan, serum ve diğer maddeler katılırsa üretme kabiliyetleri daha da artar. Örnek : Kanlı agar, Nutrient buyyon, Serumlu agar, Brain Heart Infusion Broth v. s. 15

16

2. ÖZEL BESİ YERLERİ Bu tür ortamlar incelemenin amacına göre hazırlanır ve yapıları daha komplikedir. Özel besi yerleri 7 grupta incelenebilir. 1. Selektif besi yerleri 2. Diferansiyel besi yerleri 3. Zenginleştirilmiş besi yeri 4. Zenginleştirme besi yeri 5. Biyokimyasal özelliklerin tespiti için kullanılan besi yerler 6. Özel amaçlar için hazırlanan besi yerleri 7. Sentetik besi yerleri 17

1. Selektif (Seçici) Besi Yerleri Bu besi yerlerinde istenmeyen mikroorganizmaların üremesi engellenirken (inhibisyon), üremesi istenilen mikroorganizmaların kolaylıkla üretilebilmesi sağlanır. Bu özellik, besi yerlerinin bileşimine bazı kimyasal maddelerin veya antibiyotiklerin katılması suretiyle elde edilebilir. 18

Örneğin; Gram negatif mikroorganizmaları karışık kültürlerden izole edebilmek için ortama kristal viyolet katılır (1/500. 000) ve Gram pozitiflerin üremesi inhibe edilir. Tam tersi Gram pozitifleri izole etmek için de Gram negatifleri inhibe eden potasyum tellurit veya sodyum azid katılır. Örnek: Mac Conkey agar, Edward Besi yeri, Eosin Methylene Blue agar v. s. 19

Besi yerlerini selektif hale getirmenin bir başka yöntemi de ortama antibiyotik katılmasıdır. Bu yöntem ile daha spesifik izolasyonlar (tür düzeyinde) yapılabilir. Örnek; Brucella’ların izolasyonu için ortama Brucella’ların dirençli olduğu antibiyotikler ilave edilirse Brucella Selektif Besi Yeri elde edilir. Campylobacter, 20

2. Diferansiyel (Ayırt Edici) Besi Yerleri Bu besi yerlerine, çeşitli indikatörler veya kimyasal maddelerin katılması suretiyle üreyen farklı kolonilerin aldıkları renge göre birbirlerinden ayırt edilmesi sağlanır. Örnek: l Mac Conkey agar l Eosin Methylene Blue agar l Edward Besi yeri vs. l Ayrıca Kanlı agar ile de hemolitik ve nonhemolitik koloniler birbirinden ayrılabilir. 21

22

23

24

3. Zenginleştirilmiş Besi Yerleri Bazı bakteriler (Streptococcus, Mycoplasma, Campylobacter) besiyerlerinde geç ürerler. Gözle görülebilen koloniler 2 -3 gün hatta daha uzun aman alabilir. Bu tür bakterilerin daha iyi üremelerini sağlamak için besi yerlerine kan ve serum katılır. Örnek: Kanlı agar, Serumlu buyyon 25

4. Zenginleştirme Besi Yerleri Bu tür besi yerleri, istenmeyen m. o. ların üremesine engel olan (selektif) ve izolasyonu arzu edilenin bol üremesini sağlayan zengin içerikli ve genellikle sıvı ya da yarı katı formlarda hazırlanan özel ortamlardır. Ön zenginleştirme ve transport amacı ile kullanılır. Örnek: l selenit ve tetrathionatlı buyyonlar (incelenen örneklerdeki Salmonella’ların üremesini kolaylaştıran), l Stuart Transport Besi Yeri, l Thioglikolat besi yeri v. s. 26

5. Biyokimyasal Özelliklerin Tespiti İçin Kullanılan Besi Yerleri Bu besi yerleri mikroorganizmaların identifikasyonu amacıyla kullanılır. Sıvı ve katı olarak hazırlanan bu besi yerlerinin bileşimine çeşitli indikatörler ve kimyasal maddeler katılır. Bu maddeler yardımıyla mikroorganizmaların çeşitli biyokimyasal karakterleri tespit edilir. Örnek: ¡ TSI, SIM, ¡ Üre broth, ¡ O/F, ¡ Karbonhidrat Fermentasyon besi yerleri v. s. 27

28

¡ ¡ ¡ Laktoz Glukoz Sukroz Gaz H 2 S 29

30

6. Özel Amaçlar İçin Hazırlanan Besi Yerleri Bu besi yerleri incelenen mikroorganizmalardan toksin, enzim, ara maddeler, antimikrobiyel ajanlar v. s. elde etmek için özel formüllerle hazırlanırlar ve bilimsel araştırmalarda kullanılırlar. 7. Sentetik Besi Yerleri Bu besi yerlerinin bileşimine giren maddelerin kimyasal yapıları bellidir ve özel araştırmalar için kullanılır. Bileşimlerine giren maddeler mikroorganizmaların ihtiyaçlarını tam sağlayacak durumdadır. Karbon ve enerji kaynağı olarak glukoz veya laktat, inorganik nitrojen kaynağı olarak amonyum tuzları ve çeşitli inorganik maddeler katılır. 31

Mikroorganizmaların Üretildiği Ortamlar A. Canlı ortamlar I. Doku (Hücre) kültürü II. Embriyolu yumurtalar III. Deneme hayvanları a. Konvansiyonel hayvanlar b. Spesifik Patojen Free (SPF) hayvanlar c. Germ free (Mikropsuz) hayvanlar B. Cansız ortamlar I. Genel besi yerleri II. Özel besi yerleri 1. Selektif besi yerleri 2. Diferansiyel besi yerleri 3. Zenginleştirilmiş besi yeri 4. Zenginleştirme besi yeri 5. Biyokimyasal özelliklerin tespiti için kullanılan besi yerleri 6. Özel amaçlar için hazırlanan besi yerleri 7. Sentetik besi yerleri 32

BESİ YERİNİN HAZIRLANMASI KATI BESİ YERLERİ n Toz besi yeri istenilen miktarlarda tartılır n Üzerindeki tarife göre sulandırılır, eritilir. n Otoklavda steril edilir n 40 -45 Cº’ye kadar oda ısısında veya benmaride soğutulur. n Önceden steril edilmiş cam petrilere aseptik koşullarda dökülür. n Bir petriye 15 -20 ml miktarında dökülür. n 24 saat etüvde kontaminasyon kontrolu için bekletildikten sonra kullanılabilir. 33

34

BESİ YERİNİN HAZIRLANMASI SIVI VE YARI KATI BESİ YERLERİ n Toz besi yeri istenen miktarlarda tartılır. n Üzerindeki tarife göre sulandırılır, eritilir. n Steril tüplere 5 ml olacak şekilde dağatılır n Tüplerin ağzı pamuklanarak (veya kapak) otoklavda steril edilir. n 24 saat etüvde kontaminasyon kontrolu için bekletildikten sonra kullanılabilir. 35

36

37

38