OSMOTICK FRAGILITA ERYTROCYT TEST OSMOTICK FRAGILITY DEFINICE test

OSMOTICKÁ FRAGILITA ERYTROCYTŮ

TEST OSMOTICKÉ FRAGILITY • DEFINICE • - test pomocí kterého se měří odolnost erytrocytů, vystavených hypotonickým roztokům, vůči hemolýze • Erytrocyty jsou vystaveny sérii roztoků chloridu sodného (Na. Cl), přičemž se zvětšuje ředění solného roztoku • Čím dříve dojde k popraskání erytrocytů, tím je větší jejich osmotická fragilita

• Isotonický (fyziologický) roztok – 0. 9 % Na. Cl • Erytrocyty popraskají v hypotonickém (< 0. 9 % Na. Cl) a scvrkají v hypertonickém roztoku (> 0. 9 % Na. Cl) • V hypotonickém prostředí dochází ke prasknutí membrány a vychází hemoglobin (Hb) z buněk • Měřením koncentrace Hb, lze vypočítat procento hemolýzy při různých koncentracích Na. Cl

• NORMALNÍ ROZMEZÍ • - začátek hemolýzy při: 0. 45 -0. 5 % Na. Cl • - hemolýza dokončená: 0. 3 -0. 33 % Na. Cl • FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ OSMOTICKOU FRAGILITU • - propustnost buněčné membrány • - poměr buněčného povrchu a objemu

• ZVÝŠENÁ OSMOTICKÁ FRAGILITA • - hereditární sférocytóza • - získaná sférocytóza • Hereditární sférocytóza je nemoc charakterizovaná vadnou membránou erytrocytů a sníženým poměrem povrchu a objemu • V krevním nátěru jsou vidět charakteristické kulaté buňky (sférocyty), které jsou křehčí než normální erytrocyty a praskají už v méně hypotonickém roztoku

• V hypotonickém roztoku voda vchází do erytrocytů • Proto, normální erytrocyty s bikonkávní formou v takovém prostředí bobtnají a rozšiřuje se jejich objem • Naopak sférocyty nemohou nasát moc extracelulární tekutiny a praskají snadno www. marvistavet. com

• • SNÍŽENÁ OSMOTICKÁ FRAGILITA - talasémie - srpkovitá anémie - anémie z nedostatku železa

PRACOVNÍ POSTUP • Použijeme lidskou plnou krev, která byla vypláchnuta fyziologickým roztokem a neobsahuje již plasmu, ale pouze erytrocyty. • Označíme si 5 eppendorfek čísly 1 -5 a do každé zkumavky napipetujeme 1 ml odpovídajícího připraveného roztoku: • • • roztok 1 - neředěný fyziologický roztok 2 - fyziologický roztok ředěný vodou v poměru roztok 3 - fyziologický roztok ředěný vodou v poměru roztok 4 - fyziologický roztok ředěný vodou v poměru roztok 5 - fyziologický roztok ředěný vodou v poměru obsahující NH 44 Cl (NH 4 Cl navodí zkrat zbývajících membránových pump) 3: 1 2: 1 1: 5,

• Do zkumavek 1 -5 napipetujeme po 50 μl suspenze erytrocytů, jemně promícháme a necháme 10 min. stát. Potom zkumavky zcentrifugujeme (3 000 x g, 3 min. ) a opatrně odebereme supernatant na stanovení hemoglobinu. • Připravíme 5 skleněných zkumavek 1 -5 s 2 ml Drabkinova činidla. Do každé zkumavky přidáme 50 μl supernatantu. Změříme absorbanci při vlnové délce 400 nm proti slepému vzorku (Drabkinovo činidlo)

• Vzhledem k tomu, že se nejedná o čerstvou krev, zjistíme částečnou hemolýzu i ve zkumavce č. 1. Množství hemoglobinu zde stanovené budeme považovat za kontrolu a odečteme je od hodnot naměřených ve zkumavkách 2 - 5. Množství hemoglobinu změřené ve zkumavce č. 5 je maximálně možné a vyjádříme je jako 100% hemolýzy. Na tomto základě potom vypočítáme % hemolýzy ve zkumavkách 2 - 4. • Do připraveného grafu (k dispozici v laboratoři) zaneste naměřené hodnoty absorbance a odečtěte z něho koncentraci hemoglobinu (mg/l).