IVANISE C S MOTA DIAGNSTICO DE DOENAS GENTICAS

IVANISE C. S. MOTA DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS GENÉTICAS: MÉTODOS DE RASTREAMENTO

MÉTODOS DE RASTREAMENTO Uma ampla variação de técnicas são utilizadas para a identificação de doenças genéticas. � Todos os métodos têm vantagens e desvantagens e requerem considerável habilidade e experiência para serem realizados. � Não existe uma padronização ou preferência geral por um método, mas os laboratórios devem ser conhecedores das limitações e sensibilidade dos métodos utilizados. �

Introdução Marcadores Genéticos e a Hibridização Fluorescente In Situ (FISH): Importância Crucial - Genética Clínica, Oncologia e Mutagênese Identificação de Anormalidade Cromossômicas: - Trissomias, Nulissomias, Translocações, Deleções - Amplificações Gênicas Seletivas - HSR e DM • Preparados Metafásicos - recentes ou antigos • Preparados Citológicos e Histológicos - congelados, fixados ou parafinados

Doenças Genéticas: Padrões de Herança Simples ou Complexo � Autossômicas Recessivas � Autossômicas Dominantes � Ligadas ao Cromossomo X � Poligênicas ou Multifatoriais

Testes Genéticos � Citogenético � DNA � Metabólico

Método Citogenético �A observação microscópica de cromossomos normais e anormais permitiram a construção de mapas citogenéticos do genoma de muitas espécies. Estes mapas mostram a localização relativa de características morfológicas dos cromossomos (ex: centrômeros, marcadores citogenéticos ou bandas) e lesões cromossômicas visíveis.

Mapa Citogenético � Ordem de sequências de DNA derivadas de arranjos físicos dos seus sítios de hibridação. � O método de FISH (hibridação in situ fluorescente) é o meio mais direto de localizar marcadores moleculares e genéticos no mapa citogenético permitindo a integração entre mapas genéticos e moleculares.

Método FISH Hibridação in situ fluorescente Técnica pela qual se realiza o acoplamento (hibridação) de duas fitas de DNA complementares em lâminas para microscopia. Esta técnica permite identificar a presença, ausência, quantidade ou localização de segmentos cromossômicos específicos, através de sondas de DNA (segmentos cromossômicos de sequência conhecida) marcadas com fluorocromos.

TIPOS DE SONDAS QUE PODEM SER UTILIZADAS � a) Sondas que hibridam com sequências únicas ou loco-específicas; � b) Sondas que hibridam com estruturas cromossômicas específicas (sondas constituídas de DNA repetitivo: as alfasatélites ou pericentroméricas, as betasatélites e as teloméricas); � c) Sondas que hibridam com sequências múltiplas de um mesmo cromossomo, também chamadas de “bibliotecas”, que “pintam” um cromossomo inteiro.

Tipos de Sondas: Sondas para locus único: - genes, regiões satélites, centrômeros, telômeros. . .

FISH Tipos de Sondas: Sondas para cromossomo total (WCP) FISH Interfásico FISH Metafásico

APLICAÇÕES DO FISH NA PRÁTICA CLÍNICA � A técnica de FISH pode ser utilizada para detectar, elucidar e quantificar alterações cromossômicas numéricas e/ou estruturais, tais como as encontradas em: NEOPLASIAS –Ex. : LMC caracteriza-se pela presença da translocação t(9; 22)

APLICAÇÕES DO FISH NA PRÁTICA CLÍNICA � ALTERAÇÕES CONSTITUCIONAIS (CONGÊNITAS) – Ex. : detecção de síndromes causadas por microdeleções

FISH Veiga LCS, 2003 Marcadores Genéticos e a Hibridização Fluorescente In Situ (FISH): D 17 Z 1 - ch 17 ca cabeça e pescoço LSI - c-myc ca de próstata LSI - CCND 1 ca de mama LSI - EGF-r ca de mama

FISH Sondas Oncológicas para locus único

FISH Variantes da FISH: M-FISH - FISH multicolor SKY - Cariótipo Espectral CGH - Hibridização Genômica Comparativa

Citogenética Molecular FISH / ISHI / M-FISH SKY CGH Hibridização “ in situ ” (Sondas de DNA)

FISH Interfásico Xilol Etanol 100% lâminas secar 5 min Prot. K 45ºC 5 min DA 2 x. SSC PI 5 min 2 x. SSC p. H 7. 0 Etanol 70% Etanol 80% Etanol 100% 3 x 5 -10 min 1 min 10 L 15 -20 min 10 -20 min n so secar Preparar as sondas s da Enxaguar para retirar o excesso de sonda cobrir com lamínula rubber ciment Hybrite 90ºC 12 min 37ºC overnight

FISH Análise das Imagens Axioplan-Imaging® Carl Zeiss Software ISIS® Metasystems

Considerações Finais - Método promissor - Ampla aplicação na pesquisa e na clínica - Técnica de alta sensibilidade na Citogenética - Alto custo de reagentes e sondas - Equipamento - Estação de cariotipagem

FISH - Fluorescent “in situ” hybridization [ Método Rápido; [ Alta especificidade e confiabilidade; [ Difícil otimização; [ Equipamentos e material de consumo caros; FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

FISH - Fluorescent “in situ” hybridization FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

FISH - Fluorescent “in situ” hybridization Blu e Acqua Gree n Yello w Oran ge Re d FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

• Método Cultura Celular: FISH - Fluorescent “in situ” hybridization - Sangue periférico - Medula Óssea - Tumores sólidos, etc. Ø Amostra Heparinizada Ø Meio RPMI Ø Glutamina Ø Soro Fetal Bovino Ø Fitohemaglutinina FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

FISH - Fluorescent “in situ” hybridization FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

FISH - Fluorescent “in situ” hybridization FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

FISH - Fluorescent “in situ” hybridization FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

FISH - Fluorescent “in situ” hybridization FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

FISH - Fluorescent “in situ” hybridization Sondas para DNA repetitivo Sondas para seqüência única FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

FISH - Fluorescent “in situ” hybridization Pancentromérica Telomérica FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

FISH - Fluorescent “in situ” hybridization r. RNA (NOR) Seqüências repetitivas FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

FISH - Fluorescent “in situ” hybridization WCP – Whole Chromosome Probe (Sonda para cromossomo inteiro) FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

FISH - Fluorescent “in situ” hybridization Sexo Masculino Sexo Feminino 47, XY, +21 47, XX, +21 FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

FISH - Fluorescent “in situ” hybridization 49, XXXXY FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

FISH - Fluorescent “in situ” hybridization FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

FISH - Fluorescent “in situ” hybridization FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

FISH - Fluorescent “in situ” hybridization Cromossomos inteiros Lócus FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

FISH - Fluorescent “in situ” hybridization FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

FISH - Fluorescent “in situ” hybridization Pancentroméri ca XY, 18 Whole Chromosome Probe 22 FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

FISH - Fluorescent “in situ” hybridization DAPI - Vysis® / WCP 1 - Vysis® / WCP 2 - Vysis® / WCP 4 - Vysis® FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

FISH - Fluorescent “in situ” hybridization FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

FISH - Fluorescent “in situ” hybridization Cromossomo 17 HER 2/neu Gene FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

MFISH - Fluorescent “in situ” Hybridization Multicolor M-FISH - Hibridização Fluorescente “in situ” Multicolorido

MFISH - Fluorescent “in situ” Hybridization Multicolor Ø Aquisição sequencial das imagens Ø Filtros ópticos fluorocromo-específicos Ø Recuperação da imagem Ø Pseudo-cores Ø Intensidades dos sinais.

MFISH - Fluorescent “in situ” Hybridization Multicolor 03 Fluorocromos 07 Combinações possíveis MFISH - Hibridização Fluorescente “in situ” Múltiplo

MFISH - Fluorescent “in situ” Hybridization Multicolor MFISH - Hibridização Fluorescente “in situ” Múltiplo

MFISH - Fluorescent “in situ” Hybridization Multicolor M-FISH - Hibridização Fluorescente “in situ” Multicolorido

MFISH - Fluorescent “in situ” Hybridization Multicolor M-FISH - Hibridização Fluorescente “in situ” Multicolorido

SKY – Cariótipo Espectral

SKY – Cariótipo Espectral Ø Novo método óptico Ø Única exposição através de um filtro triplo Ø Análise espectroscópica, permitindo a análise de todo o genoma e a visualização simultânea do espectro de emissão definido para cada cromossomo humano. Ø A análise espectral não é dependente da intensidade do sinal, mas apenas da imagem espectral criada pela marcação combinatória da sonda.

SKY – Cariótipo Espectral

SKY – Cariótipo Espectral

SKY – Cariótipo Espectral

SKY – Cariótipo Espectral

SKY – Cariótipo Espectral

M-FISH & SKY Desvantagens: Ø A metodologia cromossômicas requer preparações Ø Rearranjos e/ou microdeleções muitos pequenas podem não ser identificados com segurança Ø Duplicações não podem ser identificadas Ø Material de consumo, equipamentos e softwares caros.

ANÁLISE DA HIBRIDIZAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA (CGH ) Kallioniemi et al, 1992

CGH – Hibridização Genômica Comparativa DNA genômico (teste) marcado DNA genômico (controle) marcado Hibridização por 48 -72 h em metáfases normais Kallioniemi et al, 1992

CGH – Hibridização Genômica Comparativa CGH - Hibridização Genômica Comparativa

CGH – Hibridização Genômica Comparativa Filtro Vermelho Filtro Azul Filtro Verde Composição das cores CGH - Hibridização Genômica Comparativa

CGH – Hibridização Genômica Comparativa CGH - Hibridização Genômica Comparativa

CGH – Hibridização Genômica Comparativa CGH - Hibridização Genômica Comparativa

CGH – Hibridização Genômica Comparativa CGH - Hibridização Genômica Comparativa

CGH – Hibridização Genômica Comparativa CGH - Hibridização Genômica Comparativa

CGH – Hibridização Genômica Comparativa CGH - Hibridização Genômica Comparativa

Cláudio C. Silva UCG/La. Gene

Cláudio C. Silva UCG/La. Gene

CGH – Hibridização Genômica Comparativa Vantagens Ø Permite a localização de regiões com deleção ou amplificação do genoma tumoral quando comparado com DNA de referência. Ø Consiste em um método de triagem na avaliação de tumores. Ø Dependente do DNA da amostra e não de preparações cromossômicas (não requer cultivo celular) das células testadas. Ø Detecta alterações de 10 -20 Mb (uma banda cromossômica tem aproximadamente 400 Mb.

CGH – Hibridização Genômica Comparativa Desvantagens: Ø Alto custo dos equipamentos de análise de imagens Ø Incapacidade de detecção de alterações cromossômicas em regiões centroméricas e pericentroméricas Ø Dificuldade de detectar mosaicismos Ø Alterações cromossômicas em baixa freqüência podem não ser detectadas Ø Anormalidade estruturais (inversões e translocações recíprocas) não podem ser identificadas.

Citogenética Molecular - Considerações Finais ü Revolução a análise citogenética; ü Permite a identificação de microdeleções, translocações, amplificações gênicas, etc; ü Interage com o mapeamento gênico; ü Possibilita a confirmação do diagnóstico; ü Permite uma melhor compreensão de eventos moleculares;