Zkladn metdy prce s udskou DNA 2005 Katedra

Základné metódy práce s ľudskou DNA 2005 Katedra molekulárnej biológie

Izolácia DNA - v jadre bunky - v komplexe s bielkovinami Postup: 1. lýza bunkových membrán (SDS) 2. štiepenie proteínov (proteináza K) 3. odstránenie proteínov (fenol/chloroform) 4. vyzrážanie DNA (etanol)

Izolácia DNA kitom Postup: 1. lýza bunkových membrán a štiepenie proteínov 2. naviazanie DNA na kolónu 3. premytie kolóny 4. elúcia DNA 5. precipitácia DNA

Určovanie kvantity a kvality DNA Spektrofotometricky 1. kvantita – OD pri 260 nm (1 OD ~ koncentrácia 50 μg/ml) 2. kvalita – pomer OD pri 260/28 nm (ideálne ~ 1, 8) Elektroforézou 1. kvantita – porovnaním so štandardom 2. kvalita – určenie degradácie DNA

Elektroforéza DNA

Separačné média pre analýzu DNA Agaróza separácia dvojvláknovej DNA rozdiel vo veľkosti fragmentov od 10 nt Polyakrylamid Separácia jednovláknovej a dvojvláknovej DNA rozdiel vo veľkosti fragmentov od 1 nt Koncentrácia polyakrylamidu [%] Veľkosť DNA fragmentov v nt 3, 5 1000 - 2000 5 80 – 500 10 - 0, 8 8 60 – 400 0, 9 7 - 0, 5 12 40 – 200 1, 2 6 - 0, 4 15 25 – 150 2, 0 3 - 0, 1 20 6 - 100 Koncentrácia agarózy [%] Oblasť efektívneho rozdelenia molekúl DNA [kb] 0, 3 60 - 5 0, 6 20 - 1 0, 7

Vizualizácia DNA v géli Et. Br, SYBR Green (agarózový gél, polyakrylamnidový gél) – – – interkalačné činidlo ds. DNA UV lampa Ag. NO 3 (polyakrlylamidový gél) – – ss. DNA a ds. DNA denné svetlo Fluorescenčné farbičky (genetický analyzátor) – – – kovalentná väzba farbičky na primer ss. DNA laser a CCD kamera

Štiepenie DNA restrikčnými endonukleázami enzýmy súčasťou RM systému baktérií názvy podľa pôvodu 5´prečnievajúce konce, 3´prečnievajúce konce, tupé konce

Elektroforéza DNA po štiepení RE

Príprava rekombinantných DNA

Hybridizácia DNA komplementarita báz Tm (GC content)

Southernov blotting genomická DNA štiepenie RE elektroforéza oligonukleotidová sonda k unikátnej sekvencii

FISH technológia detekcia numerických a štrukturálnych chromozómových aberácií fluorescenčne značené oligonukleotidové sondy fluorescenčný mikroskop

Microarray/ DNA chip Hybridizácia fluorescenčne značenej, testovanej DNA sondou viazanou na detekčnom sklíčku

DNA microarray a DNA chip možnosti aplikácie technológií DNA microarray a DNA chip

Polymerázová reťazová reakcia (PCR) Kary B. Mullis - 1993 Nobelova cena

Princíp PCR

Verifikácia PCR amplifikácie

PCR odporúčané nastavenie úvodná denaturácia DNA – 500 ng primery 94 – 95 ºC 2 – 5 min cyklické opakovanie – 25 - 35 x – 16 – 24 nt dlhé Tm 48 – 65 ºC GC content 40 – 60 % 1 – 10 pmol/na reakciu – 50 - 500 μM záverečná polymerizácia – – – d. NTP denaturácia 94 – 95 ºC 30 – 40 s hybridizácia T = Tm – 3 ºC polymerizácia 72ºC 45 s (do 1 kb) 72 ºC Mg. Cl 2 – 1 – 5 m. M DNA polymeráza – 0, 5 – 2, 5 U 7 min Chladenie/inaktivácia reakcie 4 – 10 ºC

Sekvenovanie (Sanger) 1

Sekvenovanie (Cycle sequencing)

Pyrosequencing