ZEL BOYAMA YNTEMLER ZEL BOYAMA YNTEMLER Dkda bulunan
ÖZEL BOYAMA YÖNTEMLERİ
ÖZEL BOYAMA YÖNTEMLERİ Ø Dışkıda bulunan paraziter yapıların daha iyi saptanabilmesi için özel boyama yöntemleri uygulanması, paraziter yapıların detaylarının tanımlanması ve doğru tanının konması açısından büyük önem taşımaktadır. Ø Parazitlerin çeşitli boyanma özelliklerinden yola çıkarak, özel fiksasyonların da yardımıyla farklı sürelerde boyama işlemleri gerçekleştirilmektedir. Ø Dışkı örneklerinde Cryptosporidium, Cyclospora, Cystoisospora ookistlerinin doğrudan mikroskobik bakıda ayırt edilip tanımlanması zor olduğundan özel boyama yöntemi uygulanmalıdır. Enterobius vermicularis Hematoksilen-Eosin Trichrome Trypanasoma evasi Giemsa Echinococcus Modifiye
Preparatlardaki oositlerin yoğunluğuna göre: Ø Tüm lamda, toplam 1 -2 adet nadir oosit görüldüğünde (+) Ø 2 -3 mikroskop sahasında bir oosit görüldüğünde (++) Ø Her mikroskop sahasında oosit görüldüğünde (+++) Şeklinde oosit yoğunluğunun not edilmesi özellikle bağışıklığı baskılanmış hastaların takibinde yarar sağlayacaktır.
İnce ve kalın yayma Floresan mikroskop Şale Bir tür boya köprüsü Preparatların incelenmesi
MODİFİYE ASİDE DİRENÇLİ ZİEHL NEELSEN BOYAMA Hazırlanacak solüsyonlar Karbol fuksin yapılışı: Ø 3, 15 g bazik fuksin, 100 m. L %95’lik etanol içerisinde eritilir (Solüsyon A), Ø 5 g fenol kristali 100 m. L distile su içerisinde eritilir (Bu işlem 56◦C’lik sıcak su banyosu içinde de yapılabilir) (Solüsyon B), Ø A ve B solüsyonları karıştırılarak 1 -2 gün bekletilir, Ø Karışım kullanmadan önce filtre edilmelidir. %5 sülfürik asit yapılışı: Ø 5 mg konsantre sülfürik asit 95 m. L saf su içine karıştırılır, Ø Bu solüsyon oda sıcaklığında bir yıl saklanabilir. Loeffler’in alkali metilen mavisi yapılışı: Ø 0, 3 g metilen mavisi 30 m. L %95’lik etanol içerisinde çözdürülür, Ø Bu karışıma %0, 01’lik potasyum hidroksitten 100 m. L eklenir, Ø Bu solüsyon oda sıcaklığında bir yıl saklanabilir.
YÖNTEM 1) Etil asetat çöktürme yöntemi sonrası elde edilen çökeltiden 1 damla, lam üzerine alınıp 1 cm çapında bir daire oluşturacak şekilde yayma yapılır. Yedek olarak iki yayma hazırlanabilir. 2) Lamlar 70◦C’ye ayarlanıp ısıtılmış bloklarda 5 dakika kurutulur. 3) Lamlar boya köprüsü üzerine transfer edildikten sonra üzerleri karbol fuksin boyasıyla kapatılır ve pamuk yardımıyla yakılan alev vasıtası ile alttan 5 dakika ısıtılır, bu sırada lamdaki boyanın kaynamamasına özen gösterilmelidir, işlem sırasında boya eksilirse boya ilave edilmelidir. 4) Lamlar çeşme suyuyla yıkanır. 5) Lamlar dekolorizasyon işlemi için %5 sülfürik asit dolu şaleye aktarılarak, boyanın kalınlığına göre 30 -60 saniye arasında bekletilir. 6) Lamlar çeşme suyu ile yıkanır. 7) Lamlar karşıt boyama için Loeffler’in metilen mavisi ile dolu şaleye aktarılarak 1 dakika bekletilirler. 8) Çeşme suyunda çalkalandıktan sonra kurutulur. 9) 1 damla immersiyon yağı damlatılarak x 100’lük objektifte incelenir.
YORUM Ø Yaymalar kalın olmamalıdır, dokolorizasyonda sıkıntı yaşanabilir. Ø Öncesinde başarılı bir yoğunlaştırma işlemi istenen sonucun alınabilmesinde önemlidir. Ø Örneğin uzun süre %10 formol içerisinde bekletilirse boyama özellikleri zayıflayabilir. Menekşe: Cryptosporidium
KİNYOUN ASİDE DİRENÇLİ BOYAMA Hazırlanacak solüsyonlar Kinyoun karbol fuksin yapılışı: Ø 4 g bazik fuksin, 20 m. L %95’lik etanol içerisinde eritilir (Solüsyon A), Ø 8 g fenol kristali 100 m. L distile (damıtılmış) su içerisinde eritilir (Solüsyon B), Ø A ve B solüsyonları karıştırılır ve en az 2 gün bekletilir, Ø Karışım kullanılmadan öne filtrelenmelidir. %1 sülfürik asit yapılışı: Ø 99 m. L distile suya 1 m. L konsantre sülfürik asit ilave edilir, Ø Bu solüsyon oda sıcaklığında bir yıl boyunca saklanabilir. Loeffler’in alkali metilen mavisi yapılışı: Ø 0, 3 g metilen mavisi 30 m. L %95’lik etanol içerisinde çözdürülür, Ø Bu karışıma %0, 01’lik potasyum hidroksitten 100 m. L eklenir, Ø Bu solüsyon oda sıcaklığında bir yıl saklanabilir.
YÖNTEM 1) Etil asetat çöktürme yöntemi sonrası elde edilen çökeltiden 1 damla, lam üzerine alınıp 1 cm çapında bir daire oluşturacak şekilde yayma yapılır. Yedek olarak iki yayma hazırlanabilir. 2) Tamamen kurutulan yaymalar, boya köprüsü üzerine alınıp üzerleri 1 dakika kadar saf metanol ile kaplanarak fikse edilir. 1 dakika sonunda kurutulmak üzere alkolün fazlası boşaltılır. 3) Kinyoun karbol fuksin içeren şalede lamlar 5 dakika bekletilerek boyanır. 4) Lamlar %50 etanol içeren şalede 3 -5 saniye çalkalanır ve akabinde çeşme suyu ile çalkalanır. 5) %1’lik sülfürik asit içeren şalede 2 dakika dekolorize edilir. 6) Çeşme suyu ile çalkalanır. 7) Lamların uçları gazlı beze değdirerek üzerlerindeki fazla su alınır. 8) Karşıt boyama için Loeffler’in metilen mavisi ile dolu şaleye aktarılarak 1 dakika bekletilir. 9) Lamlar çeşme suyu ile çalkalanır ve kurutulur. 10) Bir damla immersiyon yağı damlatılarak x 100’lük büyütmede incelenir.
YORUM Ø Özellikle Cryptosporidium, Cyclospora, Cystoisospora ookistleri mavi veya açık pembe bir zemin üzerinde pembe veya kırmızı olarak görülmektedir. Cystoisospora ookistleri bazen hiç boya almazlar. Ø Tanının geciktiği durumlarda uzun dönem çeşitli antibiyotikler uygulanmış hasta örneklerindeki etkenlerin boyama özellikleri zayıflayabilmektedir. Pembe-kırmızı: Cryptosporidium
MODİFİYE TRİCHROME BOYAMA (WEBER’İN TRİCHROME BOYASI, CHROMOTYPE 2 R) Hazırlanacak solüsyonlar: Chromotrope boya solüsyonu: Ø 6 g Chromotype 2 R, 0, 15 g Fast Green ve 0, 7 g fosfotungustik asit karışımına 3 m. L glasiyel asetik asit eklenir. Ø İyice karıştırıldıktan sonra 30 dakika oda sıcaklığında bekletilir. Ø Karışıma 100 m. L distile su eklenir ve homojen hale getirilerek cam şişe içerisinde 2 yıl kullanılabilir. Asit alkol: Ø 900 m. L saf etanole 100 m. L distile su eklenerek %90’lık etil alkol elde edilir. Ø %90’lık etil alkol solüsyonundan 995, 5 m. L alınarak üzerine 4, 5 m. L glasiyel asetik asit eklenir.
YÖNTEM 1) Etil asetat çöktürme yöntemi sonrası elde edilen çökeltiden 1 damla, lam üzerine alınıp 1 cm çapında bir daire oluşturacak şekilde yayma yapılır. Yedek olarak iki yayma hazırlanabilir. 2) Tamamen kurutulan yaymalar, boya köprüsü üzerine alınıp üzerleri 5 dakika kadar saf metanol ile kaplanarak fikse edilir ve sonra kurutulmak üzere alkolün fazlası boşaltılır. 3) Lamlar Chromotrope 2 R boyası bulunan şale içerisinde 90 dakika boyanır. 4) Lamlar asit alkol içerisinde 10 saniye veya daha az süreyle çalkalanır. 5) Takip eden alkol serilerinden %95’lik etanolde 10 saniye çalkalanır. 6) İkinci %95’lik etanolde 5 dakika bekletilir. 7) %100’lük etanolde 10 dakika bekletilir. 8) İkinci %100’lük etanolde 10 dakika bekletilir. 9) Saf ksilen’de 10 dakika bekletilir. 10) Kurutulan lamlara bir damla immersiyon yağı damlatılarak x 100’lük büyütmede incelenir.
YORUM Ø Microsporidiumların 1 -3 µm boyutlarındaki morfolojileri standart boama yöntemleriyle tanımlanmalarını güçleştirmektedir. Ø Bu yöntem özellikle mantarların ayırt edilmesinde yardımcı olmaktadır. Ø Önceden Microsporidium içerdiği bilinen bir örneğin Chromotype boyama sırasın kontrol amaçlı kullanılması ideal test içi kontroldür. Kırmızı: Microsporidium
AURAMİNE BOYA YÖNTEMİ (AURAMİNE-RHODAMİNE) Hazırlanacak solüsyonlar: %0, 5 asit alkol: Ø 70 m. L saf etil alkol 30 m. L distile su ile karıştırılarak %70’lik etil alkol hazırlanır. Ø %70’lik etil alkolden 99, 5 m. L alınıp içine 0, 5 m. L HCl karıştırılarak asit alkol elde edilir. Karşıt boya: Ø 0, 5 g potasyum permanganat (KMn. O₄) 100 m. L distile su içerisinde çözdürülerek hazırlanır. Ø Kullanım öncesi iyice karıştırılmalıdır.
YÖNTEM 1) Etil asetat çöktürme yöntemi sonrası elde edilen çökeltiden 1 damla, lam üzerine alınıp 1 cm çapında bir daire oluşturacak şekilde yayma yapılır. Yedek olarak iki yayma hazırlanabilir. 2) Tamamen kurutulan yaymalar, boya köprüsü üzerine alınıp üzerleri 5 dakika kadar saf metanol ile kaplanarak fikse edilir ve sonra kurutulmak üzere alkolün fazlası boşaltılır. 3) Ticari olarak hazır satılan Auromine-Rhodamine floresan boyasında 15 -20 dakika süreyle inkübe edilir. 4) Steril distile su ile yıkanır. 5) %0, 5’lik asit alkol dolu şalede 2 -3 dakika bekletilir. 6) Steril distile su ile yıkanır. 7) KMn. O₄ solüsyonu ile dolu şalede 3 -4 dakika bekletilir. 8) Steril distile su ile yıkanır. 9) Kurutulan lamlara bir damla immersiyon yağı damlatılarak floresans mikroskobu ile 365 nm dalga boyunda incelenir.
YORUM Ø Preparatların boyama öncesinde fikse edildiğinden emin olunmalıdır. Ø Yaymalar çok kalın olmamalıdır. Ø Distile su ile tam olarak yıkanmazsa, boya kristalleri geri planda kalarak boyanın değerlendirilmesini güçleştirir. Yeşil: Eritrositler, Turuncu: Lökositler, Akridin turuncu: Plasmodium knowlesi
CALCOFLUOR WİTE BOYAMA Hazırlanacak solüsyonlar: Phospate buffered saline (PBS): Ø 1000 m. L distile su içerisinde 8 g Na. Cl, 1, 15 g Na₂HPO₄7 H₂O, 0, 2 g KOH karıştırılır. Ø Karışımın p. H’sı 1 M’lık Na. OH ile 7, 2’ye ayarlanır. Calcofluor white boyası: Ø 0, 5 g Calcofluor white tozu 100 m. L distile su içerisinde çözdürülür. Ø Kullanım öncesi iyice karıştırılır. Evan’s blue: Ø PBS içerisine %5’lik solüsyonu hazırlanır. Ø Kullanım öncesi iyice çalkalanmalıdır.
YÖNTEM 1) Etil asetat çöktürme yöntemi sonrası elde edilen çökeltiden 1 damla, lam üzerine alınıp 1 cm çapında bir daire oluşturacak şekilde yayma yapılır. Yedek olarak iki yayma hazırlanabilir. 2) Tamamen kurutulan yaymalar, boya köprüsü üzerine alınıp üzerleri 10 dakika kadar saf metanol ile kaplanarak fikse edilir. 3) Lamlar kurutularak alkolün fazlası uzaklaştırılır. 4) Fikse olmuş lamlar yayma üzerine 1 damla Calcofluor damlatılır ve 5 dakika beklenir. 5) PBS ile 1 -2 saniye yıkanır. 6) Evans blue dolu şalenin içerisinde 30 saniye bekletilir. 7) Distile su ile 1 -2 saniye yıkanır. 8) Kurutulan lamlara bir damla immersiyon yağı damlatılarak floresans mikroskobu ile 360 -370 nm dalga boyunda incelenir.
YORUM Ø Parazit sporlarının %10 formole dirençli olmaları nedeniyle, örnekler %5 -10 formolle laboratuvara ulaştırılabilirler. Ø Bu boya ile Microsporidium sporlarının endospor tabakasında bulunan kitin spesifik olarak boyanır ve sporlar floresan mikroskobu altında parlak mavi-beyaz olarak gözlemlenir. Ø Floresan mikroskobunda doğru filtre seçilmelidir. Ø Çift boyama metoduyla boyalı (CFW ve SYTOX green) Ø Rhizosiphon akinetum sporanjiyumu (A, B, C ve D) Ø Rhizophydium fragilariae (E, F ve G) Ø Beyaz ışıkla uyarılmış (A ve E), Ø UV ışık (B ve F), Ø Mavi ışık (C ve G), Ø UV ve mavi ışığın her ikisi (D) Ø Optik mikroskopla gözlendiler. Ø Bars, 10 μm. z, zoosporlar.
PARAZİTİK KOPROLOJİ
- Slides: 20