Yksek saflatrma derecesi Tekrarlanabilirlik Neden Optimizasyon Ekonomik kullanm

Yüksek saflaştırma derecesi Tekrarlanabilirlik Neden Optimizasyon ? Ekonomik kullanım Çalışma saatleri

Zaman Faktörü Hız - Çözünürlük Protein ayrımlamanın her adımında dengeye (equilibrium) ihtiyaç var: • Çöktürme işlemi • Katı bir matrikse adsorbsiyon • Solüsyon içinde hareket vb. Herhangi bir adımda dengeye ulaştıktan sonra daha fazla beklenmesine gerek yoktur. Optimum süre 15 dakika

Zaman Faktörü Hız - Çözünürlük Denge Difüzyon kontrollü: Sıcaklık ve viskozite belirler. Geleneksel düşünce Oysa Enzimler çok kararsızdır, bu nedenle devamlı olarak soğukta (0 -4 ºC) tutulmalıdır. Birçok protein oda sıcaklığına dirençlidir (ekstraselüler veya non-enzimik proteinler).

Zaman Faktörü Hız - Çözünürlük

Zaman Faktörü Hız - Çözünürlük Soğuk oda (0 -4ºC) Laboratuvar (25ºC) • Kimyasal tepkime hızı yavaş. • Tepkime hızı 3 -4 kez daha hızlı. • Bozulma olayları daha yavaş gerçekleşir. • Bozulma olayları daha hızlı gerçekleşir ancak dengeye ulaşım daha çabuk, izolasyon daha hızlı. • Sıcaklık nedeniyle inaktivasyon problemse, tercih edilmesi gereken tekniktir.

Zaman Faktörü Hız - Çözünürlük Soğukta tüm gece bekletmek = Oda sıcaklığında 4 -5 saat Eğer stabilite sınırlıysa; işlemin hızlı olması, çözünürlükten daha fazla önem taşır. Başlangıç 09. 00 İşlemin bitmesi 20. 00 Başlangıç 09. 00 İşlemin bitmesi, dondurma ve saklama 16. 00

Zaman Faktörü Hız - Çözünürlük Stabilite önemliyse, bir ayrımlama adımını takip eden ikinci adım fazla bir hazırlık gerektirmemelidir. Örneğin; Tuz içeren bir uygulamadan sonra, kalıntı tuzun adsorbsiyona engel olmadığı yerler haricinde iyon değişim tekniğini içeren bir yöntem uygulanamaz. İyon değişim tekniğini içeren bir adımdan sonra da jel filtrasyon uygulanamaz çünkü fraksiyon konsantre edilme ihtiyacı duyacaktır.

Zaman Faktörü Hız - Çözünürlük Ara işlem gerektiren çeşitli ayrımlama adımları:

Zaman Faktörü Hız - Çözünürlük Sonuç: Zaman faktörü, kararsız enzimlerle veya fazla miktarda proteolitik aktivite içeren ekstraktlarla çalışırken çok önemli olabilmektedir. Her bir işlemi mükemmel tutmaya çalışıp uzun sürede yapmaktansa, birbirini izleyen adımlar şeklinde ve biraz da çözünürlükten ödün vererek yapmak daha iyi olabilmektedir.

Enzimler ve Diğer Proteinler için Stabilize Edici Faktörler Hücre dışı enzimler istisna olmakla birlikte, hücre içi enzimler dış ortam şartlarına dayanıksızdırlar. Doğal ortamlarında: • Yüksek konsatrasyonda bulunurlar (en az 100 mg/ml), • Oksijen gerilimi düşüktür (bazen sıfırdır), • Enzimleri stabilize edici metabolitler bulunur. Laboratuvar ortamında: • Tampon içinde seyreltik halde bulunurlar, • Oksijen gerilimi yüksektir, • Lizozomal bölmelerdeki proteolitik enzimler, ekstraksiyon tamponu içinde dağılmış haldedirler.

Enzimler ve Diğer Proteinler için Stabilize Edici Faktörler Enzimlerde aktivite kaybına yol açabilecek üç tip tehdit vardır: • Denatürasyon • Katalitik bölge inaktivasyonu • Proteoliz

Enzimler ve Diğer Proteinler için Stabilize Edici Faktörler Denatürasyon Etkenler: • p. H • Sıcaklık • Organik çözeltiler gibi denatürantlar • H-bağlarını ayıran ve hidrofobik etkileşimleri

Enzimler ve Diğer Proteinler için Stabilize Edici Faktörler p. H Tamponlar, doğal p. H değerine olabildiğince yakın tutulmalıdır. Sıcakkanlı hayvan hücreleri için 37ºC’de p. H 7, 0 -7, 5 aralığındadır. Sıcaklık Termal denatürasyon. Sıcaklıktaki 10ºC’lik artış, 20 -40 kat fazla kayıba neden olabilir. Soğukkanlı hayvan dokularının oda sıcaklığında denatüre olması muhtemeldir. Soğuktan dolayı meydana gelen “soğuk denatürasyon”, molekülleri bir arada tutan hidrofobik kuvvetlerin zayıflamasından dolayı gerçekleşir. Genel bir önerme: Proteinler, normal fizyolojik sıcaklıklarının 10ºC üzerine kadar kararlılıklarını korurlar.

Enzimler ve Diğer Proteinler için Stabilize Edici Faktörler Katalitik Bölge İnaktivasyonu Etken: Enzimin aktif bölgesindeki sülfidril kalıntılarının yüksek oksijene maruz kalması sonucu okside olmasıdır. Koruyucu olarak: 1) EDTA gibi bir ajan kullanılarak tüm metal iyonlarını uzaklaştırmak, 2) β-Mercaptoethanol gibi solüsyona sülfidril içeren bir ayıraç eklemek.

Enzimler ve Diğer Proteinler için Stabilize Edici Faktörler Proteolitik Bozulma Etken: Hücrelerin kendi yıkımları veya hücre dışındaki maddeleri hücre içine alıp sindirmek için kullandıkları enzimlerden özellikle proteolitik enzimlerin ekstraksiyon sırasında diğer hücre içerikleriyle karışması. Koruyucu olarak inhibitörler: 1) DFP (di-isopropyl fluorophospahte) – tehlikeli 2) PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) 3) Pepstatin A Eğer enzimin bileşenlerden etkilenmediği biliniyorsa, taze hazırlanmış ekstraktlar için; -> 2 -5 m. M EDTA, 0, 5 -1 m. M PMSF ve 10 -7 M pepstatin A’nın eklenmesi uygundur.

Enzimler ve Diğer Proteinler için Stabilize Edici Faktörler Diğer Stabilize Edici Etkiler Çalışmalar sonucunda anlaşılmıştır ki; hücrelerdeki su, hücre içinde serbestçe dolaşır halde bulunmamaktadır. -> Düşük su aktivitesi Laboratuvar ortamında bunu taklit etmek için en çok gliserin %20 -30 (w/v) kullanılmaktadır. Aynı amaçla tampon çözeltisine şeker, şeker-alkol solüsyonları da eklenmektedir. Etkileri: + Gliserin, iyon değişimi veya jel filtrasyonu gibi tekniklerde olumsuz etkiye neden olmaz. - Tuzla çöktürmede ve sonrasında santrifüjleme işlemlerinde engelleyici etki yapabilir. + Düşük sıcaklıklardaki saklamalarda hasar verici etki gösterdiği nadirdir.