WYKAD 2 13 10 2018 Techniki chromatograficzne Chromatografia

WYKŁAD 2 13. 10. 2018

Techniki chromatograficzne

Chromatografia to metoda rozdziału mieszanin związków oparta na różnicy współczynników podziału składników mieszaniny pomiędzy dwie fazy: • Fazę stacjonarną (nieruchomą) • Fazę ruchomą

Chromatograficzne metody rozdziału mieszanin związków • Chromatografia kolumnowa (fleszowa) • Chromatografia cienkowarstwowa (TLC – Thin Layer Chromatography)

Chromatografia kolumnowa Faza ruchoma Próbka Kolumna Faza stacjonarna Fazy stacjonarne: Si. O 2, Al 2 O 3, celuloza Fazy ruchome: rozpuszczalniki organiczne, roztwory buforowe Eluat Składniki mieszaniny migrują z różną prędkością

Chromatografia kolumnowa (fleszowa) Fazy stacjonarne: Si. O 2, Al 2 O 3, celuloza Fazy ruchome: rozpuszczalniki organiczne, woda, roztwory buforowe Zbiornik fazy ruchomej Porowaty filtr Probówki do eluatu Szklana kolumna z fazą stacjonarną, np. granulowaną krzemionką

Chromatografia cienkowarstwowa Faza stacjonarna: warstwa żelu krzemionkowego na płytce Faza ruchoma: mieszanina rozpuszczalników

Chromatografia cienkowarstwowa

Chromatografia cienkowarstwowa Front rozpuszczalnika Start RF = 5. 5/11 = 0. 5

Chromatografia cienkowarstwowa RF = droga przebyta przez substancję droga przebyta przez rozpuszczalnik próbka wzorzec

Chromatograficzne metody analizy mieszanin związków • Chromatografia gazowa (GC, GLC) • Chromatografia cieczowa (HPLC) • GC lub HPLC sprzężona ze spektrometrią mas (GC-MS, LC-MS)

Chromatograf gazowy Filters/Traps Data system H RESET Regulators Syringe/Sampler Inlets Detectors Gas Carrier Hydrogen Air Column • • • gazy dozownik kolumna detektor akwizycja danych

Kolumny do chromatografii gazowej Kolumna z wypełnieniem Kolumna kapilarna

Jak działa chromatograf gazowy? Faza stacjonarna: ciekła lub stała Faza ruchoma: gaz

Chromatografia gazowa Chromatograf gazowy Mieszanina 5 substancji Sample: mixture of volatile Próbka liquids (~1 L) ~ 1 μl Gas Chromatogram B E C Abundance A D 0 5 10 Time (minutes) 15 20

Czas retencji Czas od wstrzyknięcia próbki do pojawienia się sygnału substancji na chromatogramie

Identyfikacja nieznanego związku – analiza jakościowa Mieszanina wzorców Nieznana substancja

Analiza ilościowa mieszaniny

Chromatogram estrów metylowych kwasów tłuszczowych (tzw. profil kwasów tłuszczowych)

Rodzaje kolumn do chromatografii gazowej

Rodzaje faz stacjonarnych w kolumnach do chromatografii gazowej

Rozdzielczość pików w GC

Rozdzielczość pików w GC Czynniki poprawiające rozdzielczość: Wzrost długości kolumny Zmniejszenie średnicy kolumny Zmniejszenie szybkości przepływu gazu Zmniejszenie ilości próbki Dobór innej fazy stacjonarnej Zastosowanie programowanej temperatury

Chromatogramy gazowe

Chromatografia gazowa Zalety • Doskonała rozdzielczość • Krótki czas analizy • Niewielka ilość próbki • Dobre systemy detekcji • Oznaczenia ilościowe Wady • Substancje muszą być lotne i trwałe przy temperaturze 200 -300°C

Jakie składniki żywności można analizować metodą GC? • Substancje lotne i trwałe w temp. 200 -300 C związki zapachowe, olejki eteryczne, niektóre lipidy, alkaloidy • Lotne pochodne nielotnych lub nietrwałych termicznie związków polarnych estry kwasów tłuszczowych, pochodne aminokwasów, monosacharydów

Schemat aparatu GC-MS Chromatograf gazowy Spektrometr masowy

Na czym polega spektrometria mas?

Elementy spektrometru mas? Wprowadzenie próbki Akwizycja danych Dozownik Źródło jonów Komputer Analizator mas Pompy próżniowe Detektor jonów

Widmo masowe O H 3 C C N CH C O C H 3 C N H Spektrometr mas N Typical sample: isolated compound (~1 nanogram) Próbka ~ 1 ng 194 Widmo masowe Abundance 67 109 55 82 42 136 94 40 60 80 100 120 Mass (amu) 140 165 160 180 200

Widma masowe trzech różnych węglowodorów C 6 Widmo masowe jest dla identyfikacji związku tym czym odcisk linii papilarnych podczas identyfikacji przestępcy

Schemat chromatografu cieczowego Kolumna Detektor Interfejs Pętla Akwizycja danych Dozownik Zbiornik fazy ruchomej Pompa

Chromatograf cieczowy Faza stacjonarna: granulowana krzemionka o modyfikowanej powierzchni Faza ruchoma: rozpuszczalniki organiczne, ich mieszaniny, woda, roztwory buforowe

Chromatograf cieczowy kolumna dozownik

Czas retencji sygnał Czas retencji

Jakie składniki żywności można analizować metodą HPLC? • Substancje polarne, nielotne, rozpuszczalne w wodzie (hydrofilowe), aminokwasy, peptydy, sacharydy, składniki mineralne • Substancje niepolarne, nierozpuszczalne w wodzie (lipofilowe) lipidy, alkaloidy, witaminy • Pochodne substancji lotnych lub nietrwałych

Analiza HPLC witamin rozpuszczalnych w wodzie 1. Niacyna 2. Pirydoksyna 3. Ryboflawina Kolumna: Bondapak C 18 Eluent: metanol Próbka: mieszanina witamin 4. Tiamina

Chromatogram mieszaniny 30 aminokwasów

Schemat aparatu LC-MS Chromatograf cieczowy Spektrometr mas

Zastosowania HPLC w analizie żywności • Identyfikacja i oznaczenia ilościowe składników żywności • Badanie zmian składu podczas przechowywania oraz w trakcie procesów technologicznych Węglowodany Nukleozydy Aminokwasy, peptydy, białka Aflatoksyny Witaminy Antyoksydanty Kwasy tłuszczowe, tłuszcze Zanieczyszczenia Karotenoidy, chlorofile