WP 2 A TEST DI PROLIFERAZIONE IN PRESENZA

WP 2 A) TEST DI PROLIFERAZIONE IN PRESENZA DI IDROSSIAPATITE: 10, 100, 250, 500 mg/ ml di terreno di coltura B) TEST DI PROLIFERAZIONE SU DISCHETTI IN TITANIO

Cellule utilizzate: Cellule mesenchimali staminali umane (MSC) Isolate da midollo osseo Condrociti umani Isolati da biopsie

Isolamento di cellule mesenchimali staminali da midollo osseo umano: • Le cellule vengono lavate 3 volte con PBS tramite centrifugazione a 1200 rpm per 5 min • Il pellet viene risospeso in DMEM con 10% FCS e seminato in pozzetti • Le cellule vengono poste in incubatore a 37°C e 5% CO 2 • Dopo 72 h dalla semina viene cambiato il terreno di coltura per eliminare le cellule in sospensione che non hanno aderito al pozzetto • Per la fase di espansione, il terreno di coltura viene cambiato 2 volte a settimana

Isolamento di condrociti da cartilagine umana: • Una volta lavata la biopsia con PBS all’ 1% P/S, la cartilagine viene sminuzzata con l’ausilio di un bisturi • Ai pezzi ottenuti viene aggiunta una soluzione contenente 0, 25% tripsina e 0, 02% EDTA e si lascia digerire per 15 min in incubatore • Al termine della digestione viene aspirata la soluzione e viene aggiunta collagenasi 300 U/ml • Si lascia agire over night • La digestione viene bloccata aggiungendo terreno di coltura completo • Dopo filtrazione, le cellule vengono centrifugate per 5 min a 1200 rpm e seminate su pozzetti • Per la fase di espansione, il terreno di coltura viene cambiato 1 volta a settimana

TEST DI PROLIFERAZIONE IN PRESENZA DI IDROSSIAPATITE: Condizioni di coltura: • Terreno di coltura: - DMEM completo - HAM’s F 12 completo arricchito con fattori di crescita (FGF, TGF-ß 1, EGF, insulina, glutammina) MSC Condrociti

• Concentrazione cellulare: - 20. 000 cellule/pozzetto in monostrato - 300. 000 cellule/pezzo di HYAFF • Biomateriale utilizzato: Non woven a base di estere benzilico dell’acido ialuronico (materiale HYAFF, FAB Abano Terme PD)

• Sospensione dell’idrossiapatite: - in DMEM completo (l’HA tende a precipitare) - in DMEM completo arricchito con collagene I: sono state effettuate varie prove in presenza di diverse concentrazioni di collagene (10%, 20%, 30%); la concentrazione del 30% ha dato i risultati migliori, pur non consentendo la completa dispersione dell’HA.

• Semina delle cellule in presenza di HA: - in monostrato: le cellule sono state risospese in DMEM completo con l’aggiunta di diverse concentrazioni di polvere di idrossiapatite e seminate su pozzetti - in 3 D: i pezzi di non woven sono stati pretrattati con diverse concentrazioni di HA, dispersa in DMEM completo o DMEM completo addizionato di 30% collagene I; dopo 1 h sono state seminate le cellule

Non woven contenenti HA in concentrazione 250 μg/ml Fibre del Biomateriale Cristalli di HA

Cristalli di HA Fibre del Biomateriale

TEST MTT in monostrato

TEST MTT in 3 D

Coltura a 3 gg di condrociti su biomateriale contenente HA in concentrazione 100 μg/ml Coltura a 5 gg di condrociti su biomateriale contenente HA in concentrazione 100 μg/ml

Conclusioni • In monostrato: HA ha un’azione fortemente inibente sulla proliferazione a 4 giorni di coltura. Probabilmente la difficoltà di risospendere i cristalli induce la loro precipitazione sopra le membrane cellulari distruggendole a 4 gg. • In 3 D: HA risulta avere un’azione meno inibente sulla proliferazione. Il calo della crescita cellulare a 4 giorni di coltura è più contenuto rispetto al monostrato.

TEST DI PROLIFERAZIONE SU DISCHETTI IN TITANIO Condizioni di coltura: • Terreno di coltura: - DMEM completo MSC - HAM’s F 12 completo arricchito con fattori di crescita (FGF, TGF-ß 1, EGF, insulina, glutammina) • Concentrazione cellulare: Condrociti 300. 000 cellule/dischetto