WP 1 TEST DI PROLIFERAZIONE CELLULARE SU DISCHI

WP 1 TEST DI PROLIFERAZIONE CELLULARE SU DISCHI IN : PET PTFE PET RICOPERTO DI CARBONIO

Cellule utilizzate: Cellule mesenchimali staminali umane (MSC) Isolate da midollo osseo Condrociti umani Isolati da biopsie di cartilagine

Isolamento di cellule mesenchimali staminali da midollo osseo umano: • Le cellule vengono lavate 3 volte con PBS tramite centrifugazione a 1200 rpm per 5 min • Il pellet viene risospeso in DMEM con 10% FCS e seminato in pozzetti • Le cellule vengono poste in incubatore a 37°C e 5% CO 2 • Dopo 72 h dalla semina viene cambiato il terreno di coltura per eliminare le cellule in sospensione che non hanno aderito al pozzetto • Per la fase di espansione, il terreno di coltura viene cambiato 2 volte a settimana

Isolamento di condrociti da cartilagine umana: • Una volta lavata la biopsia con PBS all’ 1% P/S, la cartilagine viene sminuzzata con l’ausilio di un bisturi • Ai pezzi ottenuti viene aggiunta una soluzione contenente 0, 25% tripsina e 0, 02% EDTA e si lascia digerire per 15 min in incubatore • Al termine della digestione viene aspirata la soluzione e viene aggiunta collagenasi 300 U/ml • Si lascia agire over night • La digestione viene bloccata aggiungendo terreno di coltura completo • Dopo filtrazione, le cellule vengono centrifugate per 5 min a 1200 rpm e seminate su pozzetti • Per la fase di espansione, il terreno di coltura viene cambiato 1 volta a settimana

Condizioni di coltura: • Terreno di coltura: - DMEM completo MSC - HAM’s F 12 completo arricchito con fattori di crescita (FGF, TGF-ß 1, EGF, insulina, glutammina) Condrociti • Concentrazione cellulare: 300. 000 cellule/dischetto

Test MTT: valutazione della proliferazione cellulare Il test viene usato per determinare la proliferazione di diversi tipi di cellule. Misura quantitativamente l’attività della succinico deidrogenasi (enzima presente nei mitocondri) nelle cellule in coltura. Il test si basa sulla conversione, ad opera dell’enzima, del composto chimico MTT, di colore giallo, in sali di colore blu. La quantità di prodotto, determinata spettrofotometricamente, è direttamente proporzionale all’attività dell’enzima e quindi al numero di cellule vitali.

PET – lato da utilizzare: A Lato B

PTFE – lato da utilizzare: A Lato B

Conclusioni Le cellule mostrano un grado di adesione maggiore sui dischetti PET e PET rivestito di carbonio. Sui dischetti di PTFE la sospensione cellulare depositata non si assorbe lasciandola per un periodo di 2 ore. Questo può pregiudicare l’adesione e la penetrazione delle cellule all’interno del materiale.