wiat maych RNA www plantcell orgcgidoi10 1105tpc 110

Świat małych RNA www. plantcell. org/cgi/doi/10. 1105/tpc. 110. tt 0210

Czym są małe RNA? • Małe RNA to populacja cząsteczek RNA o długości 21 to 24 nt, które generalnie powodują wyciszanie genów (gene silencing) • Małe RNA przyczyniają się do potranskrypcyjnego wyciszania genów (post-transcriptional gene silencing-PTGS) poprzez negatywne działanie na translację lub stabilność m. RNA AAAAA • Małe RNA przyczyniają się do transkrypcyjnego wyciszania genów (transcriptional gene silencing. TGS) poprzez epigenetyczne modyfikacje chromatyny RNA Pol Modyfikacje histonów, metylacja DNA

Podstawa wyciszania przez RNA – białka Dicer i Argonaute Wyciszanie przez RNA opiera się na dwóch podstawowych reakcjach: a) Dwuniciowy RNA (ds. RNA) jest rozcinany przez Dicer i jego homologi na krótkie dwuniciowe RNA. b) Te małe RNA asocjują następnie z białkami rodziny ARGONAUTE i powodują wyciszenie. DICER AGO Silencing

Dicer i białka podobne do Dicer W biogenezie si. RNA i mi. RNA, Dicer lub białka podobne do Dicer (Dicer-like – DCL proteins) rozcinają ds. RNA lub RNA ze spinką (hairpin) na fragmenty ~ 21 – 25 nt. Struktura Dicer’a pozwala mu „mierzyć” RNA, który rozcina. Podobnie jak kucharz szatkujący marchewkę, Dicer tnie RNA na równe fragmenty. From Mac. Rae, I. J. , Zhou, K. , Li, F. , Repic, A. , Brooks, A. N. , Cande, W. . , Adams, P. D. , and Doudna, J. A. (2006) Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science 311: 195 -198. Reprinted with permission from AAAS. Photo credit: Heidi

Białka Argonaute Białka ARGONAUTE wiążą małe RNA i ich cele Mutant Arabidopsis ago 1 i ośmiornica Argonauta argo Białka ARGONAUTE nazwano tak ze względu na wygląd mutanta Arabidopsis argonaute 1 ; ago 1 ma promieniście rozłożone liście przez co przypomina ośmiornicę o nazwie Argonauta. Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd: EMBO J. Bohmert, K. , Camus, I. , Bellini, C. , Bouchez, D. , Caboche, M. , and Benning, C. (1998) AGO 1 defines a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development. EMBO J. 17: 170– 180. Copyright 1998; Reprinted from Song, J. -J. , Smith, S. K. , Hannon, G. J. , and Joshua-Tor, L. (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science 305: 1434 – 1437. with permission of AAAS.

Wyciszanie przez RNA – obraz ogólny si. RNA- działa AGO AAAn poprzez potranskrypcyjne i transkrypcyjne wyciszanie genów AGO DCL RNA Pol Micro. RNA – działa poprzez wyciszanie m. RNA i represję translacji MIR gene DCL RNA Pol AGO AAAn AAA m. RNA n RNA Pol

si. RNA – Ochrona genomu si. RNA chronią genom poprzez: • Supresję atakujących komórkę wirusów • Wyciszanie źródeł wadliwych transkryptów • Wyciszanie transpozonów i elementów powtarzających się Oprócz tego, si. RNA utrzymują niektóre geny w stanie epigenetycznie wyciszonym Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: Nature. Lam, E. , Kato, N. , and Lawton, M. (2001) Programmed cell death, mitochondria and the plant hypersensitive response. Nature 411: 848 -853. Copyright 2001.

Wyciszanie genów indukowane przez wirusy – obraz ogólny Kodowana przez wirusa RNAzależna RNA polimeraza Wirusowy ss. RNA Większość wirusów roślin to RNA wirusy, które replikują się poprzez dwuniciowe formy pośrednie. Wirusowy ds. RNA DCL Dwuniciowy RNA jest rozcinany przez DCL wytwarzając si. RNA, które asocjują z AGO wyciszając replikację i ekspresję wirusa. AGO

Rośliny mogą obronić się przed infekcją wirusem i nabyć oporności Najmłodsze Najstarsze Inokulacja wirusem Młodsze liście wytwarzane przez roślinę zakażoną wirusem mogą być pozbawione infekcji, co wskazuje, że rosnąca roślina obroniła się przed infekcją.

Małe RNA korelują z indukowanym przez infekcję wirusem wyciszeniem genów Mały RNA homologiczny do wirusowego RNA występuje w liściachinokulowanych i odległych młodych liściach (systemic leaf), ale nie w liściach inokulowanych roztworem bez wirusa (mock), Młody liść (syst. leaf) Dni po inokulacji Inokulowany liść From Ratcliff, F. , Henderson, B. D. , and Baulcombe, D. C. (1997) A similarity between viral defense and gene silencing in plants. Science 276: 1558– 1560. Reprinted with permission from AAAS.

Infekcja wirusem powoduje systemiczną akumulację si. RNA AGO DCL Odległy liść Liść inokulowany

Wyciszenie może się rozprzestrzeniać systemicznie poprzez floem Systemiczne wyciszenie Inokulowany liść Sygnałem systemicznym jest si. RNA Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: Nature Copyright 1997. Voinnet, O. , and Baulcombe, D. (1997) Systemic silencing in gene silencing. Nature 389: 553.

Mutanty w wytwarzaniu si. RNA są bardziej podatne na infekcje wirusowe Dzikie rośliny Arabidopsis inokulowane TRV Podwójny mutant dcl 2 dcl 4 inokulowany TRV Wyciszanie wirusa TRV w dzikich roślinach Arabidopsis zapobiega występowaniu symptomów choroby. Mutanty pozbawione aktywności Dicer są niezdolne do powstrzymania infekcji. From Deleris, A. , Gallego-Bartolome, J. , Bao, J. , Kasschau, K. , Carrington, J. C. , and Voinnet, O. (2006) Hierarchical action and inhibition of plant dicer-like proteins in antiviral defense. Science 313: 68– 71. Reprinted with permission from AAAS.

Wirusy maja białka supresorowe, które zapobiegają wyciszeniu RNA Rd. RP L DC Poprzez zakłócenie procesu wyciszania RNA wirusowe białka supresorowe zakłócają mechanizm obrony rośliny przed wirusami. Supresory mogą działać na każdym etapie wytwarzania i funkcjonowania si. RNA. L DC

Małe RNA chronią także rośliny przed patogenami bakteryjnymi Rośliny dzikie (La-er) i mutanty w wytwarzaniu małych RNA (dcl 1 -9 and hen 11) inokulowane bakteriami Pseudomonas. Reprinted from Navarro, L. , Jay, F. , Nomura, K. , He, S. Y. , and Voinnet, O. (2008) Suppression of the micro. RNA pathway by bacterial effector proteins. (2008) Science 321: 964 -967. Reprinted with permission from AAAS.

Wyciszanie indukowane przez wirusy - podsumowanie • Wyciszanie genów za pośrednictwem RNA jest ważnym narzędziem w obronie roślin przed patogenami. • si. RNA zakłócają replikację wirusów. • si. RNA działają systemicznie wspomagając obronę przed wirusami i oporność roślin. • Większość wirusów wytwarza białka supresorowe procesu wyciszania RNA. Białka te stanowią ważne narzędzie w badaniu szlaków wyciszania RNA.

Wyciszanie transgenów • Transgeny wprowadzone do roślin są często wyciszane przez szlak si. RNA. • Wyciszenie może być zaindukowane przez: • Bardzo wysoki poziom ekspresji • ds. RNA pochdzące z transgenu • Nietypowe RNA kodowane przez transgen • Transgeny są wyciszane potranskrypcyjnie i transkrypcyjnie.

Wyciszanie indukowane przez transgeny W latach 1980 -tych opracowano metodę wprowadzania genów do genomów roślinnych za pomocą bakterii Agrobacterium tumefaciens. Wprowadzone geny noszą nazwe transgenów. Komórka roślinna Jądro DNA Agrobacterium tumefaciens na powierzchni komórki Photo credits: Martha Hawes, University of Arizona.

Indukowane przez transgeny wyciszanie potranskrypcyjne Doświadczenia nad modyfikacją koloru kwiatów petuni dostarczyły pierwszych dowodów na wyciszanie RNA.

Manipulacje ekspresją syntazy chalkonowej w celu modyfikacji pigmentacji kwiatów Syntaza chalkonow a (CHS) Dzika roślina petuni wytwarza purpurowe barwniki antocjanowe Syntaza chalkonowa (CHS) jest enzymem działającym na początku szlaku syntezy antocjanów Antocjany Photo credit Richard Jorgensen; Aksamit-Stachurska et al. BMC Biotechnology 2008 8: 25 doi: 10. 1186/1472 -6750 -8 -25

Spodziewane – produkcja sensownego RNA syntazy chalkonowej (CHS) zwiększy pigmentację. . . Gen własny PRO ORF Transgen Sense construct: m. RNA Translacja białka m. RNA Dodatkowa translacja białka Sensowny RNA m. RNA

. . a produkcja antysensownego RNA zablokuje pigmentację Gen wlasny PRO ORF Transgen Konstrukt sensowny: m. RNA Translacja białka m. RNA Dodatkowa translacja białka Sensowny RNA m. RNA Transgen Konstrukt antysensowny: Antysensow ny RNA Tworzy się dupleks sens-antysens, który hamuje translację

Nieoczekiwanie, zarówno antysensowny jak i sensowny konstrukt hamował wytwarzanie pigmentu Rośliny z transgenem CHS Sens OR Ca. MV 35 S pro : CHS Ca. MV 35 S pro : CHS Antysens Photo credit Richard Jorgensen

Wyciszone tkanki nie wyrażają ani własnego ani wprowadzonego genu CHS Purpurow e kwiaty Białe kwiaty To zjawisko, w którym zarówno wprowadzony, jak i własny gen ulegają wyciszeniu, nazwano kosupresją. RNA transgenu RNA własnego genu Napoli, C. , Lemieux, C. , and Jorgensen, R. (1990) Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. Plant Cell 2: 279– 289.

Kosupresja jest rezultatem wytwarzania si. RNA Dzika PRO ORF Translacja białka m. RNA Własny gen Transgeniczna z kosupresją Kosupresja Sens RNA Sense construct PRO Własny gen ORF AGO si. RNA jest wytwarzany m. RNA A AAA AGO A AAA De Paoli, E. , Dorantes-Acosta, A. , Zhai, J. , Accerbi, M. , Jeong, D. -H. , Park, S. , Meyers, B. C. , Jorgensen, R. A. , and Green, P. J. (2009). Distinct extremely abundant si. RNAs associated with cosuppression in petunia. RNA 15: 1965– 1970.

Najsilniejszym induktorem wyciszania RNA jest dwuniciowy RNA, co wykazano w badaniach na C. elegans Sensowny, antysensowny i dwuniciowy RNA homologiczny do genu unc-22 wprowadzono do C. elegans. Wyciszenie unc-22 powoduje utrate kontroli nad mięśniami, stąd nazwa unc od ang. “uncoordinated”. Senowny RNA Antysensowny RNA Brak efektu Dwuniciowy RNA Nieskoordynowane skurcze Derived The Nobel Committee based on Fire, A. et al. , (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806 -811.

Transkrypcyjne wyciszanie genów Małe RNA mogą inicjować wyciszanie DNA poprzez kowalencyjne modyfikacje DNA lub zasocjowanych z nim histonów, zakłócając w ten sposób transkrypcję. Transkrypcja Białka histonowe DNA Wyciszanie Ta forma wyciszania występuje często na stabilnie wyciszonym DNA i dotyczy np. centromerów i transpozonów, ale niekiedy dotyczy także genów.

Transkrypcyjne wyciszanie genów Ca. MV 35 S pro : KAN Ekspresja genu, który niesie oporność na antybiotyk kanamycynę Transkrypcyjne wyciszanie genów ujawniły doświadczenia, w których do roślin poprzez krzyżówki genetyczne wprowadzono więcej niż jeden transgen. Ca. MV 35 S pro : HYG Ekspresja genu, który niesie oporność na antybiotyk higromycynę Based on Matzke, M. , Primig, M. , Trnovsky, J. , Matzke, A. (1989) Reversible methylation and inactivation of marker genes in sequentially transformed plants. EMBO J. 8: 643 -649.

si. RNA mogą wskazywać DNA do wyciszenia poprzez metylację cytozyny lub za pośrednictwem enzymów modyfikujących histony a az r sfe n NH 2 N O t Me tra o l y NH 2 CH 3 N N ~ cytozyna O N ~ Dokładne mechanizmy, za pomocą których si. RNA wskazują DNA do wyciszenia nie są znane, ale wiadomo, że wymagają działania dwóch specyficznych dla roślin kompleksów RNA-polimeraz: RNA Polimerazy IV (Pol IV) i RNA Polimerazy V (Pol V). 5 -metylocytozyna DNA może być kowalencyjnie modyfikowany przez metylację cytozyny dokonywaną przez DNAmetylotransferazy. AGO DNA methyltransferase Modyfikacja histonów Metylacja DNA

Rośliny zawierają dodatkowe kompleksy RNA polimeraz, które biorą udział w wyciszaniu RNA Polimeraza DNA Kompleks Występowanie Funkcja RNA Polimeraza I Wszystkie eukariota Produkcja r. RNA Polimeraza II Wszystkie eukariota Produkcja m. RNA, micro. RNA Polimeraza III Wszystkie eukariota Produkcja t. RNA, 5 S r. RNA Polimeraza IV Rośliny lądowe Produkcja si. RNA Polimeraza V Rośliny nasienne Rekrutacja AGO do DNA

Większość si. RNAs wytwarzana jest z transpozonów i powtarzalnego DNA Chromosom Centromer Ilość małych RNA Ilość transpozonów/ retrotranspozonó w Większość komórkowych si. RNA pochodzi z transpozonów i innych powtarzalnych sekwencji. U Arabidopsis, (schemat powyżej) sekwencje te występują z wielką częstością w pericentromerycznych rejonach chromosomów. Kasschau, K. D. , Fahlgren, N. , Chapman, E. J. , Sullivan, C. M. , Cumbie, J. S. , Givan, S. A. , and Carrington, J. C. (2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis si. RNAs. PLo. S Biol 5(3): e 57.

si. RNA - podsumowanie Szlak si. RNA wycisza obce DNA, transpozony i sekwencje powtarzalne. U roślin, si. RNA są wytwarzane przez białka podobne do Dicer rozcinające ds. RNA na 24 nt si. RNA asocjuja z białkami AGO, z którymi tworzą kompleksy wyciszające. Kompleksy wyciszające mogą działać potranskrypcyjnie na docelowe RNA, przecinając je lub zakłócając ich translację. Kompleksy wyciszające mogą również działać na chromatynę, wyciszając docelowe DNA przez metylację lub modyfikacje zasocjowanych z nim histonów.

micro. RNA - mi. RNA • mi. RNA prawdopodobnie wyewoluowały z si. RNA, oba te rodzaje małych RNA są wytwarzane i obrabiane w podobny sposób. • U roślin występuje niewielka liczba silnie konserwowanych mi. RNA oraz duża liczba nie konserwowanych mi. RNA. • mi. RNA są kodowane przez specyficzne geny MIR, ale same działają na inne geny – sa czynnikami regulatorowymi działającymi w trans. • U roślin mi. RNA regulują przede wszystkim rozwój i odpowiedzi fizjologiczne

micro. RNA - mi. RNA micro. RNA przecinają m. RNA lub zakłócają ich translację Gen MIR DCL AGO Zakłócanie translacji Przecina nie m. RNA Pol II AAAn AGO AAAn AAAn m. RNA Pol II

mi. RNA i si. RNA podlegają obróbce przez pokrewne, ale odmienne białka DCL At. DCL 1 wytwarza mi. RNA DCL 1 At. DCL 2 - 4 wytwarza si. RNA DCL 4 W roślinach występuje 4 lub więcej białek DCL , więcej niż w jakichkolwiek innych organizmach. Zwiększona różnorodność i liczba białek DCL ma prawdopodobnie związek z rozbudowanym systemem ochrony przed patogenami. Reprinted from Margis, R. , Fusaro, A. F. , Smith, N. A. , Curtin, S. J. , Watson, J. M. , Finnegan, E. J. , and Waterhouse, P. M. (2006) The evolution and diversification of Dicers in plants FEBS Lett. 580: 2442 -2450 with permission from Elsevier.

mi. RNA i si. RNA asocjują z kilkoma białkami AGO 1 AGO 4 AGO 1 preferencyjnie przecina sekwencje docelowe, asocjuje z mi. RNA, ale także z niektórymi si. RNA AGO 4 preferencyjnie asocjuje z si. RNA i pośredniczy w metylalcji docelowego DNA. W Arabidopsis występuje 10 białek AGO. Nie są zbyt dobrze zcharakteryzowane. Ich funkcje częściowo się nakładają Reprinted from Vaucheret, H. (2008) Plant ARGONAUTES. Trends Plant Sci. 13: 350 -358 with permission from Elsevier.

Geny MIR są transkrybowane jako długie RNA, które są przekształcane w mi. RNA MIR gene • mi. RNA sa kodoane przez geny MIR • Pierwotny transkrypt mi. RNA (primi. RNA) składa się w strukturę dwuniciową, która podlega obróbce przez DCL 1 • Łańcuch mi. RNA* jest degradowany pri-mi. RNA 5' 3' DCL 5' 3' mi. RNA Cel mi. RNA*

Cele niektórych konserwowanych mi. RNA Rodzina genowa mi. RNA Cel (rodzina genów) Funkcja 156 Czynniki transkrypcyjne SPL Czas rozwoju 160 Czynniki transkrypcyjne ARF Odpowiedź na auksynę, rozwój 165 Czynniki transkrypcyjne HDZIPIII Rozwój, polarność 172 Czynniki transkrypcyjne AP 2 Czas rozwoju, tożsamość organów kwiatowych 390 TAS 3 (tasi. RNA), działa na czynniki transkrypcyjne ARF Odpowiedź na auksynę, rozwój 395 Transporter siarczanów Pobieranie siarczanów 399 Ubikwitynacja białek Pobieranie fosforanu Adapted from Willmann, M. R. , and Poethig, R. S. (2007) Conservation and evolution of mi. RNA regulatory programs in plant development. Curr. Opin. Plant Biol. 10: 503– 511. .

mi. RNA u roślin wykazują odległe podobieństwa do swoich celów Duplikakcja genu Uważa się, że mi. RNA u roślin powstały ze swoich sekwencji docelowych w wyniku duplikacji genów, odwróconej duplikacji i dywergencji. Tylko niektóre mi. RNA zapewniają przewagę selekcyjną i są zachowywane i duplikowane. Reprinted from Willmann, M. R. , and Poethig, R. S. (2007) Conservation and evolution of mi. RNA regulatory programs in plant development. Curr. Opin. Plant Biol. 10: 503– 511 with permission from Elsevier.

tasi. RNAs – trans-acting si. RNAS Kodowane przez geny TAS Obróbka pierwotnego transkryptu inicjowana przez mi. RNA TAS gene RNA Pol II tasi. RNA są kodowane przez geny TAS transkrybowane przez RNA Pol II Transkrypt jest celem dla mi. RNA i zostaje rozcięty AGO DICER RDR 6 Rozcięty transkrypt jest kopiowany do ds. RNA przez RNA zależną RNA polimerazę (RDR 6) (dalszy ciąg na następnym przezroczu)

Biogeneza tasi. RNA ds. RNA jest rozcinany przez DCL 4 na serię krótszych ds. RNA, uwalniając z jednego genu TAS wiele cząsteczek tasi. RNA. Arabidopsis zawiera cztery rodziny genów TAS • Celami dla TAS 1 i TAS 2 tasi. RNA sa geny kodujące białka z powtórzeniami pentapeptydowymi. • Celem dla TAS 3 tasi. RNA są czynniki transkrypcyjne ARF (auxin response factors). • Celem dla TAS 4 tasi. RNA sa czynniki transkrypcyjne MYB. DICER

Z każdego genu TAS powstaje szereg ‘przesuniętych w fazie’ tasi. RNA Miejsce wycięcia mi. RNA w pierwotnym transkrypcie tasi. RNA mogą być wytwarzane z dowolnej nici DCL 4 porusza się wzdłuż RNA mierząc i rozcianając go. Reprinted from Allen, E. , Xie, Z. , Gustafson, A M. , and Carrington, J. C. (2005) micro. RNA-directed phasing during trans-acting si. RNA biogenesis in plants. Cell 121: 207 -221, with permission from Elsevier.

Mutacje wpływające na tasi. RNA wpływają na przejście fazowe Mutacja rdr 6 -15 eliminuje wytwarzanie tasi. RNA zip-1 eliminuje wytwarzanie TAS 3 tasi. RNA Obie mutacje oraz mutacje dcl 4 i tas 3, przyspieszają zmianę fazową Reprinted from Fahlgren, N. , Montgomery, T. A. , Howell, M. D. , Allen, E. , Dvorak, S. K. , Alexander, A. L. , and Carrington, J. C. (2006) Regulation of AUXIN RESPONSE FACTOR 3 by TAS 3 ta-si. RNA affects developmental timing and patterning in Arabidopsis. Curr. Biol. 16: 939– 944 with permission from Elsevier.

nat-si. RNAs Nat-si. RNAs – Natural cis-acting si. RNAs Wytwarzane z zachodzących na siebie transkryptów. Udział w adaptacji do stresów abiotycznych i biotycznych Zachodzące geny ds. RNA z komplementarnych transkryptów AGO Wyciszeni e AGO Redrawn from Katiyar-Agarwal, S. , Morgan, R. , Dahlbeck, D. , Borsani, O. , Villegas Jr. A. , Zhu, J. -K. , Staskawicz, B. J. , and Jin, H. (2006) A pathogen-inducible endogenous si. RNA in plant immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 18002– 18007.

Zastosowania technologii małych RNA DNA tworzące si. RNA lub mi. RNA mogą być stabilnie wprowadzane do genomów roślin w celu selektywnego wyciszenia genów. Wyciszanie genów służy do eliminacji alergenów z orzeszków ziemnych. Kontrola szkodników Kontrola zainfekowana przez pasożytniczegio nicienia Oporność indukowana RNAi Wyciszanie genów służy do usuwania Rośliny wyrażające ds. RNA szkodliwych związków z odpowiadające wybranym genom nasion bawełny, co nicienia sa odporne na infekcje. Wchlonietę przez nicienia ds. RNA pozwala na ich indukuje wyciszenie jego genów. zastosowanie jako pokarmu. Huang, G. , Allen, R. , Davis, E. L. , Baum, T. J. , and Hussey, R. S. (2006) Engineering broad root-knot resistance in transgenic plants by RNAi silencing of a conserved and essential root-knot nematode parasitism gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 14302– 14306.

Podsumowanie Małe RNA biorą udział w regulacji aktywności i ochronie genomu; specyficzność ich działania wyciszającego opiera się na parowaniu zasad. Celami dla si. RNA sa bogate w sekwnecje powtarzalne rejony heterochromatyny, transpozony, wirusy i inne patogeny. Celami dla mi. RNAs i tasi. RNAs sa genby regulatorowe wpływające za czasowy i przestrzenny wzór rozwoju, homeostazę pokarmową i odpowiedzi na czynniki stresowe.