Western Blot Sample buffer Sample buffer 25 glycerol

Western Blot

Sample buffer 단백질을 변성시켜주는 요소들이 들어있는 혼합물임. ＊ Sample buffer의 조성 - 25% glycerol (25%), 2% SDS, 60 m M Tris-Hcl(p. H 6. 8) , 5% 2 -mercaptoethanol , 0. 1% BPB(Bromophenolblue) , DW. ＊ Sample buffer의 조성들의 역할 1> Glycerol: well에 단백질 혼합물이 잘 들어가게 해준다. 2> SDS: 단백질들을 음전하로 만들어 준다. 3> 2 -mercaptoethanol: 이황화 결합을 끊어 준다. 4> BPB(Bromophenolblue): indicator역할을 한다.

실험 재료 - Pipette, tip, gel cassette, hand towal, 50 ml conical tube, 15 ml conical tube, 30% Acrylamide, 1. 5 M Tris-HCl(p. H 8. 8), 0. 5 M Tris-HCl(p. H 6. 8), 10% SDS, 10% APS(Ammoniumpersulfate), TEMED, DW, isopropanol, comb, timer, 1. 7 ml epp. tube, 4 X Sample buffer, vortex, heat block, 5% skim milk, sponge, gel cassette, paper, buffer, methanol, ice, membrane 등

실험방법 ＊ SDS-PAGE gel 만들기 1> Target 단백질의 크기는 약 54 k. Da이다. 따라서 10% gel을 만들 것이다. 2> gel cassette를 실험대에 고정시킨다. 3> 10% Separating gel mixture를 만들어 Vortex한 후, 1 ml pipette을 이용하여 gel을 2/3 넣는다. 4> Separating gel의 표면을 평평하게 만들기 위해 1 ml의 isopropanol을 넣는 다. 4> 20분간 separating gel을 굳힌다. 5> Separating gel이 다 굳었으면 5% stacking gel mixture을 만들어 vortex한 후, 1 ml pipette을 이용하여 gel을 1/3 넣는다. 6> Comb를 끼고 10분 stacking gel을 굳힌다.

실험방법 ＊ 단백질 transfer 하고, antibody 붙이기 1> transfer cassette에 순서대로 sponge-paper-gel-membrane-paper-sponge 순으로 깔고 닫는다. 2> 100 V, 1 hr 동안 transfer 한다. 3> transfer가 잘 되었는지 확인 후, 5% skim milk로 1 hr 동안 blocking 한다. 4> TBST buffer로 가볍게 wash후, 1 st antibody를 overnight하여 붙인다. 5> TBST buffer로 10 min씩 3번 wash후, 2 nd antibody를 50 min동안 붙인다. 6> TBST buffer로 10 min씩 3번 wash후, exposure한다.