Western blot 1117 v Western blot 1 Cell
Western blot
11/17일 실험 개요 v. Western blot 1. Cell harvest 2. Cell lysis 3. 단백질 정량 (Sampling)
실험 개요 4. Gel electrophoresis (SDS PAGE) 5. Transfer 6. Blocking 7. 8. Primary, secondary antibody incubation Developing (using film)
Introduction Sampling
Introduction SDS-PAGE
Introduction SDS-PAGE
Introduction Western blot
Introduction Transfer
Materials & Methods Western blot 1. 표를 보고 loadin할 gel을 만든다 Running Gel 10% gel H 2 O 4. 0 30% acrylamide mix 3. 3 1. 5 M Tris (p. H 8. 8) 2. 5 10% SDS 0. 1 10% ammonium persulfate 0. 1 TEMED Stacking Gel 10 ml 0. 006 10% gel 4 ml H 2 O 2. 7 30% acrylamide mix 0. 67 1. 5 M Tris (p. H 6. 8) 0. 5 10% SDS 0. 04 10% ammonium persulfate 0. 04 TEMED 0. 004 1)15 ml tube에 각 각 Running Gel 와 Stacking Gel을 만든다. (Stacking gel에는 TEMED를 넣지 말 것!) 2)cassette에 Running Gel을 l넣는다. 3)Gel이 중화되면 Stacking Gel에 TEMED를 넣고 cassette에 넣는다. 4) Comb을 조심히 넣고 중화시킨다. (loading 할 위치를 표시해준다) <!>TEMED를 넣으면 굳기 시작하기 때문에 마지막에 넣을것! <!>TEMED를 넣고 나서 빠르게 cassette에 넣어주기.
Materials & Methods Transfer 8. Transfer 준비 : tray에 transfer buffer, 작은 통에 메탄올, 3 M paper 2개, PVDF 1장 (조 이름 기입), 핀셋 9. Cassette에서 gel을 꺼내 stacking gel과 밑 끝 부분을 제거한다 (Gel이 찢어지지 않도록 조심) -> tray로 옮긴다 10. PVDF를 메탄올에 30초 담근 후 tray로 옮긴다 11. Transfer cassette - sponge - 3 M paper - membrane – Gel - 3 M paper sponge 순서로 쌓는다 12. Transfer tank에 buffer, 얼음팩, cassette를 넣고 100 V로 1시간 transfer 13. 5% skim milk in TBS-T 용액에 1시간 incubation
Report 12+13+14 12/7 5시 까지 제출
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