WALIDACJA PODSTAWOWYCH METOD ANALIZY CUKRU BIAEGO Krystyna LISIK

WALIDACJA PODSTAWOWYCH METOD ANALIZY CUKRU BIAŁEGO Krystyna LISIK Zakład Cukrownictwa Politechnika Łódzka Szkoła Letnia, Zakopane 2006 1

Definicje Walidacja jest potwierdzeniem przez zbadanie i przedstawienie obiektywnego dowodu, że zostały spełnione szczegółowe wymagania dotyczące konkretnie zamierzonego zastosowania (wg PN-EN ISO/IEC 17025: 2005). Walidacja obejmuje: ● metody nieznormalizowane, ● opracowane lub rozwijane przez laboratorium, ● metody znormalizowane, stosowane poza zakresem normalizacji, ● w praktyce, wszystkie metody stosowane w danym laboratorium. Szkoła Letnia, Zakopane 2006 2

Podczas procesu walidacji należy określić następujące cechy charakterystyczne metod analitycznych: 1. dokładność, 6. granicę wykrywalności, 2. precyzję, 3. powtarzalność, 4. odtwarzalność, 5. niepewność wyniku pomiaru, 7. specyficzność i selektywność, 8. liniowość, 9. zakres pomiarowy. Szkoła Letnia, Zakopane 2006 3

Definicje wg PN-ISO 5725: 2002 Dokładność – stopień zgodności między wynikiem badania a przyjętą wartością odniesienia. Do opisu dokładności metody pomiarowej stosuje się dwa terminy: „poprawność” i „precyzja” Poprawność – stopień zgodności między wartością średnią otrzymaną na podstawie dużej serii wyników badania a wartością prawdziwą lub przyjętą wartością odniesienia. Szkoła Letnia, Zakopane 2006 4

Definicje wg PN-ISO 5725: 2002 Precyzja – stopień zgodności pomiędzy niezależnymi wynikami badania otrzymanymi w ustalonych warunkach. Precyzja nie ma odniesienia do wartości rzeczywistej lub innej określonej wartości. Zależy tylko od rozkładu błędów losowych (przypadkowych). Precyzja jest pojęciem, które opisuje zmienność wyników powtarzanych. Za miarę precyzji przyjmuje się zwykle odchylenie standardowe wyników badania lub jego pochodne. Im większe jest odchylenie standardowe, tym precyzja jest mniejsza. Skrajnymi przypadkami określania precyzji są warunki powtarzalności i warunki odtwarzalności. Szkoła Letnia, Zakopane 2006 5

Definicje wg PN-ISO 5725: 2002 Powtarzalność – precyzja przy spełnieniu warunków powtarzalności. Warunki powtarzalności – warunki, w których niezależne wyniki badania takich samych jednostek badania są otrzymane: ● za pomocą tej samej metody, ● w tym samym laboratorium, ● przez tego samego operatora, ● z użyciem tego samego wyposażenia, ● w krótkich odstępach czasu. Szkoła Letnia, Zakopane 2006 6

Definicje wg PN-ISO 5725: 2002 Odchylenie standardowe powtarzalności – odchylenie standardowe wyników badania otrzymanych w spełnionych warunkach powtarzalności. Jest to miara rozrzutu rozkładu wyników badania w spełnionych warunkach powtarzalności. Szkoła Letnia, Zakopane 2006 7

Definicje wg PN-ISO 5725: 2002 Granica powtarzalności – wartość, której z prawdopodobieństwem 95% nie przekracza wartość bezwzględna różnicy między dwoma wynikami badania otrzymanymi w spełnionych warunkach powtarzalności. Granicę powtarzalności oznacza się zwykle przez r. Szkoła Letnia, Zakopane 2006 8

W przypadku metod znormalizowanych, w normalnej praktyce laboratoryjnej, wykonuje się co najmniej dwa równoległe oznaczenia i porównuje różnicę bezwzględną między wynikami z pewną wartością krytyczną. Tę wartością krytyczną jest granica powtarzalności określona wzorem: gdzie: sr – odchylenie standardowe powtarzalności wyznaczone na znacznej liczbie pomiarów. Zaleca się, aby wartość bezwzględna różnicy nie przekraczała granicy powtarzalności. Jeżeli wartość ta nie przekracza r, to oba wyniki uznaje się za poprawne, a ich średnią podaje się jako wynik końcowy. Szkoła Letnia, Zakopane 2006 9

Definicje wg PN-ISO 5725: 2002 Odtwarzalność – precyzja w warunkach odtwarzalności. Warunki odtwarzalności – warunki, w których wyniki badania takich samych jednostek badania są otrzymane: ● za pomocą tej samej metody, ● w różnych laboratoriach, ● przez różnych operatorów, ● z użyciem różnego wyposażenia. Szkoła Letnia, Zakopane 2006 10

Definicje wg PN-ISO 5725: 2002 Odchylenie standardowe odtwarzalności – odchylenie standardowe wyników badania otrzymanych w spełnionych warunkach odtwarzalności. Jest to miara rozrzutu wyników badania przy spełnieniu warunków odtwarzalności. Szkoła Letnia, Zakopane 2006 11

Definicje wg PN-ISO 5725: 2002 Granica odtwarzalności – wartość, której z prawdopodobieństwem 95% nie przekracza wartość bezwzględna różnicy między dwoma wynikami badania otrzymanymi w spełnionych warunkach odtwarzalności. Granicę odtwarzalności oznacza się zwykle przez R i wyraża wzorem: gdzie: s. R – odchylenie standardowe odtwarzalności. Szkoła Letnia, Zakopane 2006 12

Definicje wg PN-ISO 5725: 2002 Niepewność wyniku pomiaru – parametr związany z wynikiem pomiaru, charakteryzujący rozrzut wartości, które można w uzasadniony sposób przypisać wielkości mierzonej. Laboratorium powinno ustalić procedurę szacowania niepewności wyniku pomiaru (analiz), otrzymanego daną metodą. Miarą niepewności może być np. odchylenie standardowe (lub jego wielokrotność) albo połowa szerokości przedziału ufności, odpowiadającego określonemu prawdopodobieństwu. Szkoła Letnia, Zakopane 2006 13

Definicje wg PN-ISO 5725: 2002 Warunki powtarzalności pośredniej – warunki, w których niezależne wyniki badania takich samych jednostek badania są otrzymane: ● za pomocą tej samej metody, ● w tym samym laboratorium, ● z użyciem tego samego wyposażenia, ● przez różnych operatorów, ● w dłuższych odstępach czasu. Szkoła Letnia, Zakopane 2006 14

Badania własne - Cel badań Wyznaczenie w warunkach powtarzalności cech charakterystycznych znormalizowanych, oficjalnych, metod analizy cukru białego stosowanych w Laboratorium Analityki Cukrowniczej Instytutu Chemicznej Technologii Żywności. Szkoła Letnia, Zakopane 2006 15

Badania własne - Metodyka badań Zwalidowanio 7 podstawowych metod analitycznych stosowanych do oceny jakości cukru białego: ● oznaczenie polaryzacji - metoda ICUMSA GS 2/3 -1 (1994), ● oznaczenie wilgotności - metoda ICUMSA GS 2/3 -15 (1994), ● oznaczenie związków redukujących - metoda Knighta i Allena z EDTA ICUMSA GS 2/3 -5 (2001), metoda Instytutu Berlińskiego PN-A-74855 -5: 1998, ● oznaczenie zabarwienia roztworu cukru - metoda ICUMSA GS 2/3 -10 (2005), ● oznaczenie typu zabarwienia cukru krystalicznego - metoda ICUMSA GS 2 -13 (1998), ● oznaczenie zawartości popiołu konduktometrycznego - metoda ICUMSA GS 2/3 -17 (2002). Szkoła Letnia, Zakopane 2006 16

Badania własne - Metodyka badań Każde oznaczenie wykonano w 10 powtórzeniach w warunkach powtarzalności, tj: ● w tej samej próbie cukru, ● za pomocą tej samej metody, ● w tym samym laboratorium, ● z użyciem tego samego wyposażenia, ● w krótkich odstępach czasu, ● przez tego samego analityka. Szkoła Letnia, Zakopane 2006 17

Badania własne - Metodyka badań Na podstawie uzyskanych wyników pomiarów wyznaczono cechy charakterystyczne badanych metod: ● wartość średnią, ● rozstęp, ● odchylenie standardowe powtarzalności, ● względne odchylenia standardowe powtarzalności, ● współczynnik zmienności, ● granice powtarzalności. Szkoła Letnia, Zakopane 2006 18

Badania własne - Metodyka badań Wyznaczone parametry porównano z precyzją określoną w: ● przepisach ICUMSA, ● rozporządzeniu Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 13 lutego 2004 r. w sprawie metod analiz niektórych produktów i półproduktów przemysłu cukrowniczego, ● polskich normach PN-A-74855 dotyczących metod badań. Szkoła Letnia, Zakopane 2006 19

Badania własne - Wyniki Uzyskane wyniki są przedstawione w kolejnych tabelach 1 -15 Szkoła Letnia, Zakopane 2006 20

Tabela 1. Parametry statystyczne – walidacja metody oznaczania polaryzacji cukru białego Wyniki Liczba pomiarów 10 Wartość średnia 99, 781 °Z Najmniejsza wartość 99, 71 °Z Największa wartość 99, 83 °Z Rozstęp 0, 12 °Z Odchylenie standardowe powtarzalności 0, 0502 °Z Względne odchylenie standardowe powtarzalności Współczynnik zmienności Granica powtarzalności Szkoła Letnia, Zakopane 2006 0, 00050 0, 050 % 0, 140 °Z 21

Tabela 2. Porównanie precyzji oznaczania polaryzacji cukru białego W warunkach powtarzalności różnica Δ między wynikami dwóch równoległych oznaczeń nie powinna przekraczać: ICUMSA GS 2/3 -1 (1994) Rozp. MR i RW z dnia 13. 02. 2004 r. PN-A-74855 -5: 1998 Cukier. Metody badań Badania własne Δ 0, 066 Z Δ 0, 1 Z Δ 0, 066 Z = 0, 140 Z Wynik podaje się z dokładnością 0, 01 Z Wynik podaje się z dokładnością 0, 1 Z Szkoła Letnia, Zakopane 2006 22

Tabela 3. Parametry statystyczne – walidacja metody oznaczania wilgotności cukru białego Wyniki Liczba pomiarów 10 Wartość średnia 0, 0103 % (m/m) Najmniejsza wartość 0, 008 % (m/m) Największa wartość 0, 013 % (m/m) Rozstęp 0, 005 % (m/m) Odchylenie standardowe powtarzalności 0, 00132 % (m/m) Względne odchylenie standardowe powtarzalności Współczynnik zmienności Granica powtarzalności Szkoła Letnia, Zakopane 2006 0, 128 12, 8 % 0, 0037 % (m/m) 23

Tabela 4. Porównanie precyzji oznaczania wilgotności cukru białego W warunkach powtarzalności różnica Δ między wynikami dwóch równoległych oznaczeń nie powinna przekraczać: ICUMSA GS 2/1/3 -15 (1994) Równoległe oznaczenia są poprawne, jeżeli żadne z nich nie różni się więcej niż o ± 10 % od średniej arytmetycznej. Nie ma danych o precyzji metody z testów międzylaboratoryjnych. Rozp. MR i RW PN-A-74855 -4: 1996 z dnia 13. 02. 2004 Cukier. Metody badań Badania własne Δ 0, 02 % (m/m) Δ 0, 005 % (m/m) =0, 004 % (m/m) Wynik podaje się z dokładnością 0, 01 % (m/m) Szkoła Letnia, Zakopane 2006 24

Tabela 5. Parametry statystyczne – walidacja metody Knighta i Allena oznaczania inwertu Wyniki Liczba pomiarów 20 Wartość średnia 0, 0047 % (m/m) Najmniejsza wartość 0, 004 % (m/m) Największa wartość 0, 006 % (m/m) Rozstęp 0, 002 % (m/m) Odchylenie standardowe powtarzalności 0, 000979 % (m/m) Względne odchylenie standardowe powtarzalności Współczynnik zmienności Granica powtarzalności Szkoła Letnia, Zakopane 2006 0, 208 20, 8 % 0, 0027 % (m/m) 25

Tabela 6. Porównanie precyzji oznaczania inwertu metodą Knighta i Allena W warunkach powtarzalności różnica Δ między wynikami dwóch równoległych oznaczeń nie powinna przekraczać: ICUMSA GS 2/3 -1 (2001) Rozp. MR i RW z dnia 13. 02. 2004 Δ 0, 004 % (m/m) Δ 0, 005 % (m/m) W zakresie: 0, 009 % ÷ 0, 04 % PN-A-74855 -6: 1998 Cukier. Metody badań Badania własne Δ 0, 01 % (m/m) =0, 003 % (m/m) Wynik podaje się z dokładnością 0, 001 % (m/m) Szkoła Letnia, Zakopane 2006 26

Tabela 7. Parametry statystyczne – walidacja metody Instytutu Berlińskiego oznaczania inwertu Wyniki Liczba pomiarów 20 Wartość średnia 0, 0161 % (m/m) Najmniejsza wartość 0, 014 % (m/m) Największa wartość 0, 019 % (m/m) Rozstęp 0, 005 % (m/m) Odchylenie standardowe powtarzalności 0, 00173 % (m/m) Względne odchylenie standardowe powtarzalności Współczynnik zmienności Granica powtarzalności Szkoła Letnia, Zakopane 2006 0, 108 10, 8 % 0, 0048 % (m/m) 27

Tabela 8. Porównanie precyzji oznaczania inwertu metodą Instytutu Berlińskiego W warunkach powtarzalności różnica Δ między wynikami dwóch równoległych oznaczeń nie powinna przekraczać: ICUMSA nie zaleca Metody Instytutu Berlińskiego do oznaczania inweru w cukrze białym Rozp. MR i RW z dnia 13. 02. 2004 PN-A-74855 -6: 1998 Cukier. Metody badań Badania własne Δ 0, 02 % (m/m) Δ 0, 01 % (m/m) =0, 005 % (m/m) w cukrze przemysłowym Wynik podaje się z dokładnością 0, 01 % (m/m) Przy zawartości inwertu 0, 016 % (m/m) Szkoła Letnia, Zakopane 2006 28

Tabela 9. Parametry statystyczne – walidacja metody oznaczania zabarwienia roztworu cukru białego Wyniki Liczba pomiarów 10 Wartość średnia 16, 56 IU Najmniejsza wartość 16, 2 IU Największa wartość 17, 2 IU Rozstęp 1, 0 IU Odchylenie standardowe powtarzalności 0, 328 IU Względne odchylenie standardowe powtarzalności Współczynnik zmienności Granica powtarzalności Szkoła Letnia, Zakopane 2006 0, 0198 2, 0 % 0, 92 IU 29

Tabela 10. Porównanie precyzji oznaczania zabarwienia roztworu cukru białego W warunkach powtarzalności różnica Δ między wynikami dwóch równoległych oznaczeń nie powinna przekraczać: ICUMSA GS 2/3 -10 (2005) Rozp. MR i RW z dnia 13. 02. 2004 PN-A-74855 -7: 1998/ AZ 1: 2005 Cukier. Badania własne Metody badań Δ 3 IU Nie zawiera Δ 3 IU procedury oznaczania W zakresie do 50 IU zabarwienia roztworu W zakresie do 50 IU cukru białego Szkoła Letnia, Zakopane 2006 D= 0, 9 IU Przy zabarwieniu 17 IU 30

Tabela 11. Parametry statystyczne – walidacja metody oznaczania typu zabarwienia cukru krystalicznego Wyniki Liczba pomiarów 10 Wartość średnia 1, 778 Najmniejsza wartość 1, 74 Największa wartość 1, 82 Rozstęp 0, 08 Odchylenie standardowe powtarzalności 0, 0326 Względne odchylenie standardowe powtarzalności Współczynnik zmienności Granica powtarzalności Szkoła Letnia, Zakopane 2006 0, 0183 1, 8 % 0, 091 31

Tabela 12. Porównanie precyzji oznaczania typu zabarwienia cukru krystalicznego - reflektancji W warunkach powtarzalności różnica Δ między wynikami dwóch równoległych oznaczeń nie powinna przekraczać: ICUMSA GS 2 -13 (1998) Δ 0, 135 Refleksometr Sucroflex firmy Dr Kernchen Rozp. MR i RW z dnia 13. 02. 2004 PN-Cukier Metody badań Nie zawiera procedury oznaczania reflektancji Szkoła Letnia, Zakopane 2006 Badania własne D= 0, 091 Refleksometr Succharoflex firmy Schmidt&Heansch 32

Tabela 13. Parametry statystyczne – walidacja metody oznaczania popiołu konduktometrycznego Wyniki Liczba pomiarów 10 Wartość średnia 0, 0121 % (m/m) Najmniejsza wartość 0, 0117 % (m/m) Największa wartość 0, 0126 % (m/m) Rozstęp 0, 0009 % (m/m) Odchylenie standardowe powtarzalności 0, 000291 % (m/m) Względne odchylenie standardowe powtarzalności Współczynnik zmienności Granica powtarzalności Szkoła Letnia, Zakopane 2006 0, 024 2, 4 % 0, 00081 % (m/m) 33

Tabela 14. Porównanie precyzji oznaczania popiołu konduktometrycznego W warunkach powtarzalności różnica Δ między wynikami dwóch równoległych oznaczeń nie powinna przekraczać: ICUMSA GS 2/3 -17 (2002) Δ 0, 00115 % (m/m) Rozp. MR i RW z dnia 13. 02. 2004 Nie zawiera procedury oznaczania Przy przeciętnej popiołu zawartości popiołu 0, 0123 konduktometrycznego % (m/m) PN-A-74855 -8: 1998 Cukier. Metody badań Badania własne Δ 0, 005 % (m/m) =0, 00081 % (m/m) Wynik podaje się z dokładnością 0, 01 % (m/m) Szkoła Letnia, Zakopane 2006 Przy zawartości popiołu 0, 0121 % (m/m) 34

Tabela 15. Zestawienie precyzji oznaczania podstawowych metod analizy cukru białego Oznaczanie ICUMSA Rozp. MR i RW z dnia 13 lutego 2004 r. PN-Cukier Metody badań Badania własne Polaryzacja [°Z] 0, 066 0, 140 Wilgotność [%] --- 0, 02 0, 005 0, 004 Inwert metodą Knighta i Allena [%] 0, 004 0, 005 0, 01 0, 003 Zabarwienie roztworu [IU] 3 --- 3 0, 9 Reflektancja [typ] 0, 135 --- 0, 091 Popiół konduktometryczny [%] 0, 00115 --- 0, 005 0, 00081 Δ - różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych w warunkach powtarzalności Szkoła Letnia, Zakopane 2006 35

Podsumowanie Na podstawie wyznaczonych cech charakterystycznych metod analitycznych wykazano, że oficjalne metody stosowane do oceny jakości cukru białego w Laboratorium Analityki Cukrowniczej są wykonywane poprawnie i spełniają wymagania zawarte w przepisach ICUMSA, w rozporządzeniu Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 13 lutego 2004 r. oraz w polskich normach dotyczących metod badań. Szkoła Letnia, Zakopane 2006 36

Literatura 1. Dobecki M. (red. ): Zapewnienie jakości analiz chemicznych. Instytut Medycyny Pracy im. prof. J. Nefera, Wyd. 3, Łódź 2004, ISBN 83 -88261 -14 -2. 2. PN-ISO 5725 -1: 2002. Dokładność (poprawność i precyzja) metod pomiarowych i wyników pomiarów. Część 1: Ogólne zasady i definicje. 3. PN-ISO 5725 -2: 2002. Dokładność (poprawność i precyzja) metod pomiarowych i wyników pomiarów. Część 2: Podstawowa metoda określania powtarzalności i odtwarzalności standardowej metody pomiarowej. 4. PN-ISO 5725 -3: 2002. Dokładność (poprawność i precyzja) metod pomiarowych i wyników pomiarów. Część 3: Pośrednie miary precyzji standardowej metody pomiarowej. 5. PN-ISO 5725 -4: 2002. Dokładność (poprawność i precyzja) metod pomiarowych i wyników pomiarów. Część 4: Podstawowe metody wyznaczania poprawności standardowej metody pomiarowej. 6. PN-ISO 5725 -5: 2002 Dokładność (poprawność i precyzja) metod pomiarowych i wyników pomiarów. Część 5: Alternatywne metody wyznaczania precyzji standardowej metody pomiarowej. 7. PN-ISO 5725 -6: 2002 Dokładność (poprawność i precyzja) metod pomiarowych i wyników pomiarów. Część 6: Stosowanie w praktyce wartości określających dokładność. 8. PN-ISO/IEC 17025: 2005. Ogólne wymagania dotyczące kompetencji laboratoriów badawczych i wzorcujących. Szkoła Letnia, Zakopane 2006 37