Vyuit HPLC v analze potravin HPLC aplikace 1

Využití HPLC v analýze potravin HPLC aplikace 1

HPLC aplikace 2

HPLC aplikace 3

Stanovení přirozených složek potravin HPLC aplikace 4

Lipidy • Nasycené a nenasycené triacylglyceroly – zpracování potravin • Nízká stabilita triacylglycerolů obsahujících nenasycené mastné kyseliny • Reakce se světlem a kyslíkem – vznik hydroperoxidů – ovlivnění chuti a kvality tuků • Falšování přídavkem jiných tuků, použití ztužených tuků – stanovení obsahu triacylglycerolů (př. falšování olivového oleje) Stanovení triacylglycerolů, hydroperoxidů, sterolů a vitaminů • UV-DAD spektra – stopy hydroperoxidů nasycené x nenasycené triacylglyceroly • Př. nenasycené triacylglyceroly v olivovém oleji – charakteristické spektrum • Příprava vzorku – extrakce petroletherem, rozpuštění v THF HPLC aplikace 5

Profil triacylglycerolů Starý slunečnicový olej Odezva při 240 nm – hyroperoxidy HPLC aplikace 6

Analýza olivového oleje 280 nm – konjugované dvojné vazby – špatná kvalita oleje HPLC aplikace 7

Profil triacylglycerolů v olivovém oleji HPLC aplikace 8

Mastné kyseliny • Stanovení nenasycených mastných kyselin C 4 -C 22 • Př. máslo a margariny se liší v zastoupení kyseliny máselné v triacylglycerolech • Stanovení jednotlivých mastných kyselin • Hydrolýza (horký metanol a KOH), online derivatizace (bromid fenacylbromidu zavedení chromoforu) - HPLC/UV HPLC aplikace 9

Složení tuku HPLC aplikace 10

Sacharidy • Glukosa, galaktosa, rafinosa, fruktosa, mannitol, sorbitol, laktosa, maltosa, cellobiosa, sacharosa • Nepřítomnost chromoforu nebo fluoroforu: nelze UV-VID nebo FLD • RID – hladiny mg/kg • Elektrochemická detekce - hladiny µg/kg • Příprava vzorku (dle matrice): odplynění, filtrace, extrakce, SPE přečištění HPLC aplikace 11

Stanovení sacharidů HPLC aplikace 12

Vitaminy Přírodní i syntetické Zlepšení nutriční hodnoty potravin Ve vodě rozpustné vitaminy: C, B 6, B 2, B 12 V tuku rozpustné vitaminy: E, D, A Hladiny µg/kg Labilní (světlo, teplo) UV, DAD – kvalitativní i kvantitativní stanovení Elektrochemická detekce HPLC aplikace 13

UV detekce HPLC aplikace 14

Elektrochemická detekce Vitaminový přípravek HPLC aplikace 15

V tuku rozpustné vitaminy UV detekce HPLC aplikace 16

V tuku rozpustné vitaminy Elektrochemická detekce HPLC aplikace 17

Tokoferoly – normální fáze HPLC aplikace 18

Stanovení tokoferolů v extraktu margarinu FLD detekce HPLC aplikace 19

Biogenní aminy • Stanovení biogenních aminů • Volné aminy přítomny v potravinách a nápojích (ryby, sýry, víno, pivo) • Maximální přípustné hladiny MRL • derivatizace HPLC aplikace 20

UV detekce Víno - po derivatizaci (dansyl chlorid) HPLC aplikace 21

Aminokyseliny • • • Primární a sekundární aminokyseliny v jednom stanovení Stanovení původu masných výrobků – falšování potravin Chirální stacionární fáze stanovení D a L formy Automatická online derivatizace - předkolonová, FLD detekce Příprava vzorku: hydrolýza (HCL, enzym) HPLC aplikace 22

STANOVENÍ AMINOKYSELIN Příprava hydrolyzátu pro stanovení aminokyselin - převedení aminokyselin, které jsou převážně vázané v bílkovinách, do formy volných aminokyselin Analytická koncovka – přesnost, správnost, rychlost HPLC Separace - ionexy (automatické analyzátory aminokyselin) reverzní fázi - oktadecyl (C 18), gradientová eluce Detekce a kvantifikace – po předchozí derivatizaci Derivatizace před i za kolonou, UV i fluorescenční detekce interní standard kompenzuje: nižší výtěžky derivatizační reakce ztráty při přípravě vzorku variabilní objem při nástřiku vzorku Jako vnitřní standardy se používají: norleucin, norvalin, aminomáselná kyselina, -aminomáselná kyselina a homoserin, mohocystin, ethanolamin aj. HPLC aplikace 23

Derivatizační činidla o-Phthaldialdehyd (OPA) 9 -fluorenyl-methyloxycarbonyl chlorid (FMOC-Cl) Ninhydrin Dansylchlorid AQC (6 -aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamát) Phenylisothiokyanát (PITC) HPLC aplikace 24

o-Phthaldialdehyd (OPA) Reakce o-phthaldialdehydu za přítomnosti merkaptoethanolu s primárními aminokyselinami - rychlá, za laboratorní teploty Výhoda - sám nefluoreskuje, deriváty s aminokyselinami mají vynikající fluorescenci excitační maxima 340 nm, emisní maxima 450 nm Nevýhoda - reaguje pouze s primárními aminokyselinami HPLC aplikace 25

Separace OPA derivátů aminokyselin Chromatografické podmínky Gradient: solvent A: 15 m. M Na 2 HPO 4 p. H 7, 2/tetrahydrofuran (96+4); solvent B: 15 m. M Na 2 HPO 4/CH 3 OH/CH 3 CN (40+36+24). Průtok: 3, 5 ml/min; 26 HPLC aplikace program: 0 -100 % B/A, 27 min. Kolona: Radial Pak 5 m C 18 cardtridge.

Porovnání vlastností jednotlivých derivatizačních činidel používaných k derivatizaci aminokyselin Charakteristika OPA FMOC-Cl Ninhydrin Dns-Cl AQC PITC Detekce FLD UV UV (FLD) FLD UV Citlivost fmol pmol (nmol) fmol pmol Stabilita derivátu špatná dobrá -- dobrá střední Rychlost derivatizace rychlá malá rychlá střední Sekundární aminokyseliny ne ano ano ano Interference reagentu ne ano ano Interference matrice malý střední ne malý ne vysoký HPLC aplikace 27

Stanovení aminokyselin v pivu po derivatizaci (OPA) HPLC aplikace 28

Stanovení aminokyselin v bramborách (HPLC/FLD v reverzní fází, derivatizace OPA) Podmínky stanovení: analytická kolona: MERCK, Lichro. CART (250 x 4 mm), Li. Chrospher 100 RP-18 (5 m) analytická předkolona: MERCK, Lichro. CART (4 x 4 mm), Li. Chrospher 100 RP-18 (5 m) teplota kolony: 30 °C mobilní fáze: 0, 01 M Na 2 HPO 4; 0, 013 m. M Na 2 EDTA; methanol (Merck); p. H 6, 4 gradientová eluce: 0 – 15 min. 28 - 50 % methanolu 15 -20 min. 50 % methanolu průtok: 0, 7 ml/min nástřikový program: 10 μl derivatizačního činidla a 10 μl vzorku bylo v nástřikové smyčce desetkrát promícháno a po minutové prodlevě byl proveden nástřik na kolonu FLD detektor: ex = 340 nm; em = 455 nm 29 HPLC aplikace

D, L-alanin Chirální separace optických izomerů kolona : 25 cm x 4 mm stac. fáze : Nucleosil Chiral-1 eluent : 1 m. M vodný roztok (CH 3 COO)2 Cu (p. H = 5, 6) průtok eluentu : 1, 2 ml/min teplota : 60 ˚C detekce : UV 240 nm 1. D-alanin 2. L-alanin HPLC aplikace 30

Bílkoviny kolona : 25 cm x 9, 4 mm stac. fáze : Zorbax GF-250 eluent : 130 m. M Na. Cl + 20 m. M KCl + 50 m. M Na 2 HPO 4 (p. H = 7, 0) průtok: 1 ml/min detekce : UV 210 nm 1. myší Ig. M, Mh = 900 000 2. hovězí thyroglobulin, Mh = 669 000 3. β-amylasa z brambor, Mh = 200 000 4. hovězí serum albumin, Mh = 66 000 5. kuřecí albumin, Mh = 45 500 6. hovězí RNAasa, Mh = 13 700 7. azid (tmax), Mh = 65 HPLC aplikace 31

Stanovení peptidů fytochromu V semenech ovsa rostoucích ve tmě HPLC/UV a MS detekce UV mapování HPLC aplikace 32

Stanovení peptidů fytochromu semena ovsa rostoucí ve tmě LC-MS TIC MS spektrum T 12 a T 58 HPLC aplikace 33

Deriváty purinu kolona : 30 cm x 4 mm stac. fáze : Nucleosil 50 -5 eluent : methanol-voda-dichlormethan 47: 17: 936 (v/v/v) průtok: 0, 8 ml/min detekce: UV 280 nm 1. kofein 2. theofyllin 3. theobromin HPLC aplikace 34

HPLC/UV analýza fytoestrogenů (po SPE přečištění) přečištění SPE bez přečištění HPLC aplikace 35

Stanovení glykoalkaloidů v rajčatech LC-MS/MS Porovnání HPLC-UV a LC-MS/MS metody HPLC-UV a LC-MS/MS chromatogram vzorku R 40 (zelené rajče) LC-MS/MS 20 x nižšího LOD, lepší opakovatelnost a výtěžnost ve srovnání s HPLC-UV (vhodná pro zralá rajčata) Parametry metody HPLC-UV Analyty Tomatin Opakovatelnost 4% Výtěžnost Dehydrotomatin 85, 0% (100 mg/kg) Nelze stanovit LC-MS/MS Tomatin Dehydrotomatin 2, 6% 3, 1% 94, 4% (9 mg/kg) 82, 9% (0, 9 mg/kg) Detekční limit (LOD) 2 mg/kg HPLC aplikace 0, 1 mg/kg 0, 05 mg/kg Mez kvantifikace (LOQ) 6 mg/kg 0, 3 mg/kg 0, 15 mg/kg 36

Potravinářská aditiva HPLC aplikace 37

Acidulanty a regulátory kyselosti Kyselina sorbová a citrónová Octová, propionová, jantarová, adipová, mléčná, fumarová, jablečná, vinná kyselina • Ochucovadla - zintenzivnění chuti, maskování nežádoucích pachutí • Pufrování – kontrola p. H (zpracování potravin, finální výrobky) • Konzervační prostředky, zamezení růstu mikroorganismů • Prevence žluknutí a hnědnutí – antioxidační účinky • Úprava viskozity pečených výrobků • Přídavky při tavení - tavené sýry, cukrovinky • Zlepšení barvy a chuti při konzervování masa Destilace s vodní parou, SPE HPLC UV/DAD HPLC aplikace 38

Bílé víno HPLC aplikace 39

Citrónová kyselina ve vodce HPLC aplikace 40

Antioxidanty HPLC aplikace 41

HPLC/UV-VIS (DAD) antioxidantů Žvýkačka HPLC aplikace 42

Konzervační prostředky Benzoová kyselina Sorbová kyselina Propionová kyselina Methyl-, propyl- estery p-hydroxy benzoové kyseliny (PHB. methyl, PHB-propyl Inhibice růstu mikroorganismů Prodloužení životnosti potravin HPLC aplikace 43

HPLC/UV-VIS (DAD) HPLC aplikace 44

Umělá sladidla Acesulfam Aspartam Sacharin Nízkokalorická sladidla: nápoje Regulace hladin – legislativa Možný toxický účinek HPLC aplikace 45

Aspartam On-column derivatizace, PR chromatografie Srovnání spektra derivatizovaného (OPA) a nederivatizovaného aspartamu HPLC aplikace 46

Syntetická barviva Použití: při zpracování potravin ve farmaceutickém průmyslu v chemickém průmyslu Zakrytí kazů, zvýraznění barvy potravin, zamaskování vlivů zrání a stárnutí Zlepšení přitažlivosti potravin Kontrola kvality, stanovení stopových koncentrací původních látek a degradačních produktů – vývoj citlivých a selektivních analytických metod HPLC/UV-VIS - charakteristická maxima 400 nm (žlutá) – 500 nm (červená) – 600 – 700 nm (zelená, modrá, „černá“) 47 HPLC aplikace

Syntetická barviva v limonádě Spektra žlutého, červeného, modrého a „černého“ barviva HPLC aplikace 48

Ochucovadla Zlepšení chuti potravin Nejčastěji použité látky: Esenciální oleje (silice), hořké látky, ostré pálivé látky Příklady: • Lupulon a humuklon (hořké látky chmele) • Vanilin • Naringenin a hesperidin (hořké látky) Nejčastěji používaná metoda: GC (head-space, SPME) HPLC – málo těkavé látky, tepelně nestabilní látky HPLC aplikace 49

Vanilin HPLC/UV, RP Kvalita extraktu vanilinu HPLC aplikace 50

Stanovení vanilinu v koňaku Identifikace srovnáním spekter HPLC aplikace 51

Hořké látky: hesperidin a naringenin Pomerančový džus HPLC/UV, RP HPLC aplikace 52

Rezidua a kontaminanty HPLC aplikace 53

Aplikace v reziduální analýze Analýza stopových množství sledovaných látek: - vysoká citlivost analytické metody - nízké meze stanovitelnosti (závisejí na citlivosti a šumu použitého detektoru, na zředění látky při průchodu kolonou a na rušivých vlivech daných složkami mobilní fáze či kontaminanty v mobilních fázích nebo v analyzovaném vzorku. Pro ideální (gaussovský) profil píku lze odvodit vztah mezi výškou píku, zaznamenaného detektorem, a koncentrací látky ve vzorku, dávkovaném do chromatografu, Zlepšení citlivosti - ovlivnění faktorů na pravé straně rovnice, tak aby byla výška píku maximální. Snížení mezí detekce - zvýšení odstupu signálu od šumu Snížení šumu - termostatovaná kolona a cela detektoru, použití čerpadel se stabilním hladkým průtokem, mobilních fází připravených z velmi čistých složek (zejména při gradientové eluci), důkladně odplyněných a přečištěním vzorku 54 HPLC aplikace

Nejčastější aplikace Stanovení reziduí léčiv (stanoveny MRL) (dobytek drůbež, maso, mléko, vejce …; působení rezistence) • Chemoterapeutika (sulfonamidy, antibiotika …) • Antiparazitika • hormony Mykotoxiny Polyaromatické uhlovodíky Pesticidy Příklady: HPLC aplikace 55

Rezidua léčiv ve vzorcích vajec HPLC/UV-VIS (DAD); RP HPLC aplikace 56

Stanovení reziduí tetracyklinů v mase HPLC/UV-VIS (DAD); RP LOD 0, 1 mg/kg HPLC aplikace 57

Mykotoxiny: Fumonisiny - Fusarium monoliformae LC/MS MS spektra fumonisinu B 1, 2, 3 HPLC aplikace 58

Identifikace fumonisinů ve vzorcích kukuřice, Následná konfirmace dle fragmentových iontů HPLC aplikace 59

Mykotoxiny HPLC aplikace 60

Mykotoxiny HPLC aplikace 61

Mykotoxiny Aflatoxiny HPLC UV/FLD HPLC aplikace 62

HPLC/FLD stanovení zearalenonu Porovnání přečištění pomocí SPE a GPC Zearalenon manuálně SPE - výtěžnost 109 % HPLC aplikace SPE - opakovatelnost 31 % x ASPEC 92 % 3% 63

Bisphenol A diglycidyl-ether (BADGE) LC/MS CID (collision induced dissociation) Extrakt z tuňáka; 0, 2 mg/kg; 1 μl nástřik HPLC aplikace 64

Bisphenol A diglycidyl-ether (BADGE) LC/MS CID (collision induced dissociation) Extrakt ze sardinek; 20 mg/kg; 1 μl nástřik HPLC aplikace 65

Pesticidy Rezidua pesticidů ve vzorku salátu Carbendazim – výtěžnost pouze 40% HPLC aplikace 66

Stanovení reziduí pesticidů ve vzorcích papriky HPLC aplikace 67

Karbamáty Nesystémové insekticidy HPLC/FLD Pokolonová derivatizace (OPA/Na. OH) Materiál: ovoce, zelenina HPLC aplikace 68

Karbamáty Analýza standardů HPLC aplikace 69

Glyfosát systémový herbicid HPLC/FLD Pokolonová derivatizace Standard HPLC aplikace 70

FUNGICIDY o. Extrace z ovoce: dichlormetan Kolona: Nucleosil 7 C 18 eluent : 5 g/l kys. mravenčí + Na. OH o (p. H 7, 5) 40 % se 60 % methanolu o 1. thiabendazol 2. o-fenylfenol 3. Difenylamin 4. Ethoxychin 5. bifenyl HPLC aplikace 71

PAH HPLC/DAD UV spektrum HPLC aplikace 72

Parametry DAD a FLD stanovení HPLC aplikace 73

LOD: DAD, FLD HPLC aplikace 74

IDENTIFIKACE / KVANTIFIKACE - HPLC/FLD (po GPC přečištění) olej, 10 mg matrice v nástřiku ex/em 216/336 nm jablka, 250 mg matrice v nástřiku HPLC aplikace 75