Vitamina C funzioni metaboliche mantenimento metalli in forma

Vitamina C: funzioni metaboliche • mantenimento metalli in forma ridotta • cattura di specie reattive di ossigeno • sintesi del collageno • assimilato dall’uomo attraverso la dieta (no biosintesi) Vitamina C: • usato come additivo alimentare • farmaco • sintesi prevalentemente chimica (Reichstein e/o sue varianti) • sintesi in natura: animali e piante (figura) 1 2 3 4 5 6 7

Figura 34. 3. 1 - Biosintesi della vitamina C nelle piante (a destra) e negli animali (a sinistra). 9, J = esoso chinasi, 8 = fosfo glucomutasi, 7 = glucosio-1 P uridil trasferasi, 6 = UDP glucosio deidrogenasi, 5 = glucuronato-1 P uridil trasferasi, 4 = glucuronato chinasi, 3 = glucuronato reduttasi. 3 a = uronolattonasi, 2 = aldonolattonasi, 2 a = gulurono lattone reduttasi, 1 = gulono lattone ossidasi; I = glucosio-6 P isomerasi, H = mannosio-6 P isomerasi, G = fosfo mannomutasi, F = mannosio-1 P guanilil trasferasi, E = GDP mannosio epimerasi, D = idrolasi, C = fosfatasi, B = galattosio deidrogenasi, A = galattono lattone deidrogenasi.

USO del LIEVITO per la PRODUZIONE 1. Organismo GRAS (S. cerevisiae) 2. Produce acido eritro ascorbico da arabinosio: Arabinosio arabinono lattone eritro-ascorbato (C 5) 3. Sintesi simile a quella delle piante: Galattosio galattono lattone ascorbato (C 6) 4. Eritro-ascorbato: proprietà chimiche simili all’ascorbato ARA ALO

PROPRIETA’ DEGLI ENZIMI DI LIEVITO ALO e ARA • arabinosio • galattosio 1, 4 lattoni • gulono lattoni • galattono lattoni • arabino lattoni ARA (in vitro) ALO (in vivo, in vitro, ricombinanti in E. coli) • arabino lattoni • galattono lattoni • ascorbato • eritroascorbato BASSA SPECIFICITA’ DI SUBSTRATO Lievito + galattosio ARA, ALO endogene Ascorbato intracellulare

SCOPO DEL LAVORO: 1. Sovraespressione dei geni biosintetici (ALO e ARA) e attività su C 6 2. Rilascio ascorbato nel terreno di coltura 3. Uso di lieviti alternativi (Z. bailii)

Attività ALO - Produzione di acido ascorbico intracellulare in presenza di: • GALATTONO LATTONE (Gal) • GULONO LATTONE (Gul) ALO mantiene una bassa specificità di substrato (Gal e Gul) in vivo ALO presente anche in Z. bailii

Attività ARA - Produzione di acido ascorbico intracellulare in presenza di: • GALATTOSIO Bassa specificità di substrato in vivo di ARA presente anche in Z. bailii

MAPPA METABOLICA Arabinosio ARA Arabino lattone ALO Eritro ascorbato (lievito) Galattosio ARA/LGDH (galattosio deidrogenasi) Galattono lattone ALO/AGD (galattono lattone deidrogenasi) Ascorbato (lievito/A. thaliana) Gulono lattone Gul. O (gulono lattone ossidasi) Ascorbato (R. norvegicus)

SECREZIONE ASCORBATO DA LIEVITI RICOMBINANTI Galattosio Galattono lattone ARA Galattono lattone Tpi. ALO 1 Tpi. AGD Ascorbato GENI SOVRAESPRESSI Ascorbato secreto Funziona!

Secrezione di ascorbato in seguito a somministrazione di galattono-lattone a lieviti sovra-esprimenti ALO 1 o AGD

Secrezione di ascorbato in seguito a somministrazione di galattosio a lieviti sovra-esprimenti ALO 1 o AGD

SECREZIONE ASCORBATO DA LIEVITI RICOMBINANTI GENI SOVRAESPRESSI Galattosio Tpi. ARA 1 Tpi. LGDH Galattono lattone ALO Ascorbato secreto Non funziona!

Secrezione di ascorbato in seguito a somministrazione di galattosio a lieviti sovra-esprimenti ARA 1 o LGDH Sovra-espressione simultanea Aumentata Secrezione

Uso di Zygosaccharomyces bailii ricombinante per la produzione di ascorbato Caratteristiche di Z. bailii: • osmofilo • acidofilo • termotollerante • resistente a sostanze chimiche Vantaggi di processo Secrezione di ascorbato

BIOCONVERSIONE di galattosio da lievito ricombinante sovraesprimente ALO 1 o ALO 1 + LGDH

Prospettive: • Uso di altre vie metaboliche. Esempio gulono lattone ossidasi (Gul. O) di topo per ora solo ascorbato intracellulare • Riempimento del buco metabolico tra glucosio (substrato a basso costo) e galattosio (substrato ad alto costo) Sauer M et al. Production of L-ascorbic acid by metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae and Zygosaccharomyces bailii (2004) Appl. Environ. Microbiol. 70: 6086 -6091