Viry a jejich strategie 6 1 vod 6

Viry a jejich strategie 6. 1 Úvod 6. 2 Bakteriofág lambda 6. 3 Virus chřipky 6. 4 HIV

5. 1 Úvod - definice viru Virus = buněčný parazit Virion = virus mimo buňky, inertní částice Virion = kapsida (= strukturní protein[y]) + genom + (enzymy) + (membránový obal) Genom = 1 typ NA (DNA nebo RNA), ss. NA x ds. NA, kružnicový x lineární Virus využívá enzymatického aparátu buňky k reprodukci: A) Nikdy nekóduje vlastní translační aparát B) Nikdy nekóduje enzymy drah energetického metabolizmu Význam virů: nemoci, výzkum buněk, genové inženýrství/terapie

Rozdělení virů 1) Podle hostitele (živočišné, rostlinné, bakteriální) 2) Podle replikační strategie: DNA viry (DNA → DNA): ss. DNA, ds. DNA RNA viry (RNA → RNA): +RNA, -RNA, ds. RNA Retroviry (RNA → DNA → RNA) 3) Obalené x neobalené Evoluční původ virů Nejistý. Dokonce je možný různý původ různých skupin. 1) Redukce buněčných parazitů 2) Buněčné RNA/DNA ("osvobozený plasmid") 3) Katalytické autoreplikující se RNA (relikt RNA světa)

Virová částice Kapsida (kapsomera = strukturní jednotka): 1) ikosaedrální 2) helikální 3) pleiomorfní 4) komplexní Skupiny virů napadající člověka

Interakce viru s hostitelem 1) 2) Vstup do buňky (endocytóza, fúze, poraněná buňka) Lytický cyklus/Chronická infekce/Latence

Virové strategie Vysoká mutabilita (zejména RNA viry) Tlak na malou velikost genomu Nutnost zajistit celý replikační cyklus Využití buněčných struktur Poměrně zajímavé strategie na molekulární úrovni Virové "triky" při translaci

6. 2 Bakteriofág lambda • Napadá E. coli • Ikosahedrální hlavička (2 druhy proteinů) • Nekontraktilní ocásek + tenké vlákno na konci • Genom: lineární ds. DNA (47 kbp), kohezní konce (cos sekvence) Počátek infekce: 1) Adsorbce na buňku (přes mal. B - transportér maltózy) 2) Cirkularizace genomu (cos místa, buněčná ligáza) 3) Genová exprese (velmi časné a časné geny) 4) Replikace 5) Výběr reprodukční strategie Souvislosti: Genové inženýrství

Dvě různé životní strategie Lytický cyklus: Syntéza virových proteinů Tvorba virových částic Lyze buňky Lysogenie (profág): Integrace do genomu (bakterie se dělí) Stres - aktivace Vystřižení z genomu pak lytický cyklus

Lytická dráha Souvislosti: DNA Pokud má buňka dostatek živin Replikace Vznikají konkatemery - ty se štěpí na jednotlivé genomy O protein = analog Dna. A, P protein = analog Dna. C Exprese genů pro virovou částici a lyzi buňky Lysogenní dráha Pokud nemá buňka dostatek živin Zastavení replikačního cyklu (příslušné proteiny nejsou exprimovány) Integrace fágovy DNA do bakteriálního genomu = profág Bakterie s profágem je imunní vůči infekci stejným druhem fága Reaktivace: při poškození DNA (stres), vystřižení λ genomu, lytický cyklus

Cro a CI: dva hlavní hráči Cro represor a CI (λ represor): váží specifické DNA sekvence Cro = lytický cyklus, CI = lysogenní cyklus Represorový systém λ fága: Promotor PRM CI-OR 3 -OR 2 -OR 1 -Cro (OR - operátor) Promotor PR Vazba CI do OR 1 → represe transkripce Cro, vyšší afinita pro vazbu dalšího CI do OR 2 Vazba CI do OR 2 → represe transkripce Cro Vazba CI do OR 3 (pouze vysoké koncentrace CI) → represe transkripce CI Vazba Cro do OR 3 → represe transkripce CI Cro represor

Genová exprese Velmi časné x pozdní lytické x pozdní lysogenní Regulace genové exprese: 1) aktivace iniciace transkripce (CII) 2) represe iniciace transkripce (CI, Cro) 3) antiterminace transkripce (N, Q) 4) antisense RNA (protisměrná transkripce) (anti-Cre, anti-Q) 5) 3´ koncová m. RNA degradace (Sib sekvence) Promotor Produkty Regulace iniciace Regulace terminace PL N, CIII, xis-int-sib CI N PR Cro, CII, O, P, Q N PR´ lýze, hlava, ocas PI int CII PRM CI Cro PAQ anti-Q RNA CII PRE anti-Cro RNA, CI CI Q

Genom bakteriofága λ att. P = místo integrace Sib = RNA vlásenka signál pro 3´ koncovou degradaci

Integrace do bakteriálního genomu Lysogenie - virus ve formě profága Souvislosti: DNA - Rekombinace Místně specifická konzervativní rekombinace int = integráza xis = regulátor integrázy Integrací do genomu se přeruší regulační sekvence sib Situace: xis > int (lytický cyklus, sib) nic xis < int (exprese CII - exprese int z PI): integrace xis = int (reaktivace, není sib): vyštěpení

Lytická dráha p. L p. RM N p. I p. RE Represe iniciace p. R p. AQ head Cro Antiterminace CIII Antiterminace xis int Sib sekvence: RNáza III degraduje od 3´ konce xis > int, neintegrace p. R´ O tail P lyze Q CII Buněčné proteázy Velmi časné geny Časné geny Rozhodnutí o lytickém cyklu Replikace genomu Assembly virionů Lyze buňky

Lysogenní dráha p. L N p. RM p. I p. RE iniciace CI Represe iniciace a Cro CIII xis int Antiterminace int > xis integrace p. R Cro p. AQ p. R´ vazba antisense RNA O P a. Q Časné geny Rozhodnutí o lysogenii STOP reprodukce Integrace Q CII Velmi časné geny Iniciace transkripce Exprese pouze CI

Reaktivace viru p. L N CIII xis p. RM p. I p. RE iniciace CI Represe iniciace Antiterminace autoproteolýza Rec. A* int xis = int, excise Chybí sib sekvence p. R p. AQ p. R´ head Cro Antiterminace O tail P lyze DNA poškození SOS response CI štěpení Excise Lytický cyklus Q CII Nestabilní při SOS response

*Transdukce Horizontální přenos genetické informace virem 2 možnosti 1) Specializovaná: Po reaktivaci viru (proběhla lysogenie) Chybné vystřižení, okolí inzerce 2) Obecná: Nezávislé na integraci Zabalení buněčné DNA

5. 3 Influenza virus Virus chřipky Hostitelé: obratlovci 3 rody: A, B, C (A - pandemie, ptačí chřipka) Genom: [-] RNA, segmentovaný (8 molekul), 13. 5 kb Kóduje 10 proteinů Obalený: hemagglutinin (vstup), neuraminidáza (výstup) Obsah virové partikule: genom + replikáza + akcesorické proteiny Mutabilita replikázy (RNA dep. RNA pol. ): 10 -4 Buňka nelyzuje, ale stejně umírá (šok) Napadá epithely dých. soustavy Označení kmenů podle typů HA a NA molekul Dnes nejčastější: H 1 N 1, H 3 N 2 Pandemie: H 2 N 2 (? ), H 1 N 1, H 2 N 2, H 3 N 2

Proteiny viru chřipky

Replikační cyklus Trvá cca 6 hodin 1) HA - se váže na sialovou kyselinu glykoproteinů epithelu 2) Endocytóza - acidifikace (M 2) - fúze membrán - uvolnění viru 3) [-]RNA s proteiny putuje do jádra (výjimka mezi RNA viry) 4) Syntéza [+]RNA vlákna 5) Genová exprese: A) obalové proteiny - sekreční dráha B) replikační proteiny - jádro (NP, PB 1, PB 2. . . ) C) útok na buňku (NS 1, stop translace, protivirová obrana) 6) Shluky HA a NA - assembly genomu + proteinů 7) Pučení viru, odštěpení sialové kyseliny (NA), uvolnění viru

Specifika reprodukce Závislý na buněčné DNA (replikaci) "Dekapitace" buněčných m. RNA (PB 2) Hlava (+ cca 20 nt) slouží jako primer pro transkriptázu PB 1 Dva druhy [+]RNA: m. RNA (cap + tail) a c. RNA (replikace, neupravené konce) NP reguluje poměr c. RNA/m. RNA, když ↑NP, ↓m. RNA

Replikační cyklus - ilustrace

*Imunizace (očkování) Protilátka (imunoglobulin) = protein produkovaný B lymfocyty Mohutné přestavby genu pro Ig → specifita Vazba antigenu - neutralizace + signál pro další složky IS 1) Aktivní imunizace Neinfekční (oslabený vyšlechtěný nebo gen. modifikovaný) patogen 2) Genetická imunizace (nový typ AI) Podání expresního vektoru nesoucího gen pro antigen 3) Pasivní imunizace Podání protilátek (matka/plod, hadí uštknutí) Genetická imunizace

Interakce s IS hostitele Hemagglutinin a neuraminidáza (povrch) jsou cílem terapie i IS Mutabilita: mění povrchové vlastnosti Antigenní drift: bodová mutace, změna epitopu Antigenní shift: současné napadení buňky 2 kmeny viru, výměna Protilátky proti HA - nejúčinnější Protilátky proti NA - méně učinné Protilátky proti nukleoproteinu - neúčinné

Mezidruhová bariéra Bariéra mezi ptačím a lidským virem (HA) Ptačí viry jsou nejvariabilnější (rezervoár) Ptačí původ měla většina pandemií Prasata - mohou být napadena lidským i ptačím virem

6. 4 Human immunodeficiency virus Nobelova cena 2008 AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) Objeven 1983 HIV 1 (Pan troglodytes, Šimpanz čego) HIV 2 (Cercocebus atys, Mangabej bělokrký) Napadá buňky IS: CD 4+ T lymfocyty (T 4), makrofágy (tropismus) - mutace Genom: 2 x [+]RNA, 10 kb, 9 genů Retrovirus (RNA→DNA) Obalený (gp 120, gp 140) Mutabilita: 3 x 10 -5

Replikační cyklus 1) Adsorbce na receptor + koreceptor 2) Fúze obalu s membránou buňky 3) Reverzní transkripce (ss. RNA → ds. DNA) 4) Transport ds. DNA do jádra, integrace 5) Na viru nezávislá aktivace buňky (nutná pro replikaci viru), TF: NF-κB 6) Transkripce, translace a processing proteinů 7) Transkripce genomové RNA 8) Organizace nezralých nukleokapsid (gag, gag-pol, 2 x RNA, t. RNA) 9) Pučení virionů, maturace (rozstříhání polyproteinu) 10) Lyze buňky (jen T 4)

Genom HIV Ve virionu 2 molekuly RNA (pseudodiploidní, 1 DNA) ve vazbě s t. RNA (primer) Běžné retroviry: pouze Gag, Pol, Env LTR: Regulační sekvence U 3, R, U 5 Gag: Strukturní p. kapsidy Pol: Replikace Env: Obal Tat: Transkripce Rev: Transport a regulace m. RNA Vpr: Transport DNA do jádra Vpu: Pučení virionů, superinfekce Nef: Brání superinfekci Vif (blok deaminace)

Vstup do buňky Receptor: CD 4 Koreceptor: CCR 5 u M, CXCR 4 u T 4 Env: V 3 sekvence zodpovědná za tropismus T-tropní viry: fúze nakažené buňky s jinou T 4

Replikace genomu Reverzní transkriptáza: RNA dep. DNA pol. DNA dep. DNA pol RNáza H PP: polypurinová sekvence

Integrace Integráza (z polyproteinu Pol) 1. Štěpení 2. Ligace Vznik přímých repetic (okolo místa inzerce) Místně specifická transpoziční rekombinace Náhodné místo v genomu (specificita se vztahuje k c. DNA viru) Souvislosti: DNA - Rekombinace

Transkripce LTR U 3: Promotor, enhancery, start R: Polyadenylační signál Transkripční interference, pouze levý promotor je funkční RNA pol. II (cap, poly(A)) Jediný transkript

Regulace sestřihu m. RNA 1) Vícenásobný sestřih → Rev protein 2) Rev protein stabilizuje ne zcela sestřižené m. RNA A) Jednoduše sestřižené m. RNA B) Nesestřižené m. RNA (genomové)

Genová exprese: triky Frameshift (posun čtecího rámce): Gag nebo Gag-Pol Alternativní sestřih Překrývající se geny Polyproteiny Posttranslační štěpení

Vliv na hostitele Napadá klíčové buňky imunitního systému (T 4): problém T 4 buňky umírají: A) Následkem replikace viru B) Apoptoticky (programovanou smrtí) C) Vlivem T 8 cytotoxických lymfocytů Zdravotní následky: 1) Suprese imunity: oportunistické infekce, nádory 2) Poškození mozku (demence), makrofágy Souvislosti: Buněčný cyklus Souvislosti: Buněčná signalizace

Průběh infekce Rezistence: Mutace v genu pro koreceptor CCR 5 -Δ 32 (5 - 14 % Evropanů) 1 alela - zpoždění cca o 2 roky, 2 alely silná rezistence, není neg. efekt Akutní fáze (připomíná chřipku): ↑↑HIV, ↓↓T 4 Latentní fáze: ↓HIV, ↑T 4, ↑ protilátky/T 8 - stagnace AIDS: ↑HIV, ↓T 4, ↓ protilátky/T 8

Léčba Mutabilita → rezistence, proto kombinovaná léčba HAART: highly active antiretroviral therapy A) Inhibitory reverzní transkriptázy B) inhibitory proteázy Inhibitor proteázy: reakce

Shrnutí • • • Vir = nebuněčná částice, reprodukující se v buňce Základní dělení virů: DNA, RNA, retro Existuje mnoho různých virových strategií Modelové viry (patogeny, E. coli) Virus je vázán na omezený okruh hostitelů Využití buněčných procesů/struktur pro svůj prospěch