VIRUSOLOIJA VRUSI UN RPUSHROMOSOMU ENTISKIE ELEMENTI Vrusu entika

VIRUSOLOĢIJA (VĪRUSI UN ĀRPUSHROMOSOMU ĢENĒTISKIE ELEMENTI) Vīrusu ģenētika

Vīrusu ģenētika. Mutāciju tipi: bioķīmiskais raksturojums; fenotipiskā izpausme Vīrusu mutāciju biežums Mijiedarbības starp vīrusiem un starp vīrusu un šūnu fenotipiskā sajaukšanās reasortiments palīgvīrusi interference restrikcija - modifikācija Lītiskais un lizogēnais attīstības cikls, imunitāte Transdukcija

Mutāciju tipi: viena nukleotīda nomaiņa: tranzīcija vai transversija; misssense, nonsense vai klusējošās; nukleotīdu insercijas vai delēcijas; rekombinācija; genoma mutācijas: translokācijas; inversijas; delēcijas; duplikācijas.

Vīrusu ģenētika Nulles mutācijas: gēna inaktivēšana (nonsense, missense) nonsense supresija E. coli sup amber ochre opal UAG ser, glu, tyr, leu UAA (UCG) (CAA) (UAU) (UUG) UGA D, E, F, P Temperatūras jutības (ts) mutācijas: letālas (missense) t. RNS nosacīti Saimnieku loka mutācijas Plaka lielums, rezistence, enzīmu mutācijas. “karstie” mutanti, attenuētie (novājinātie mutanti)

Mutāciju biežums G –genoma lielums (b. p. ); Ge – kodējošā genoma lielums; mb – mutāciju biežums uz vienu b. p. replikācijas ciklā; mg – mutāciju biežums uz vienu genomu replikācijas ciklā; meg – mutāciju biežums uz vienu kodējošā genoma ekvivalentu replikācijas ciklā; J. W. Drake, B. Charlesworth, D. Charlesworth, J. F. Crow Rates of Spontaneous Mutation Genetics, Vol. 148, 1667 -1686, 1998

Mutāciju biežums

Mutāciju biežums

Mutāciju rezultāts R. Sanjua, et al. (2004)The distribution of fitness effects caused by singlenucleotide substitutions in an RNA virus (VSV) PNAS, 101, 8396– 8401

HOMOLOGĀ REKOMBINĀCIJA Kopijas izvēle (copy choice) mehānisms vīrusu replikācijā Pavedienu apmaiņas (strand exchange) mehānisms eikariotu šūnu replikācijā Mutāciju kartēšana, atlase pēc pazīmes atjaunošanas ( marker rescue) īpašībām, saimniekšūnas genomu fragmentu iekļaušana vīrusā

REASORTIMENTS fragmentētu genomu saturošiem vīrusiem Iespējas vakcīnas izstrādei, izmantojot gripas vīrusa genoma reasortimentu

Vīrusu ģenētika Fenotipiskā sajaukšanās

Vīrusu ģenētika Fenotipiskā sajaukšanās

Vīrusu ģenētika Fenotipiskā sajaukšanās

Vīrusu ģenētika Fenotipiskā sajaukšanās

Vīrusu ģenētika Palīgvīrusi

HIMĒRĀS VĪRUSVEIDĪGĀS DAĻIŅAS

Vīrusu ģenētika Interference Defektīvās daļiņas konkurē par apvalka proteīniem kavē replikāciju

DNS / DNS hibridizācija (Southern blotting)

DNS zonde K DNS zonde S Membrānas apstrāde – hibridizācija ar zondi K Ad 12 5’-gala Kpn. I fragments, 589 b. p. No inficētām šūnām attīrīta DNS Viriona DNS

DNS zonde K DNS zonde S Membrānas apstrāde – hibridizācija ar zondi S 3 x (+ 273 b. p. no Ad 12 33845 – 34118) 2 x (+ 273 b. p. no Ad 12 33845 – 34118) + 273 b. p. no Ad 12 33845 - 34118 Ad 12 3’-gala Sac. I fragments, 615 b. p. Viriona DNS No inficētām šūnām attīrīta DNS

Kā veidojas Ad 12 genoma 3’-gala “liekā” sekvence ?

Vīrusu ģenētika Restrikcija - modifikācija

Baktēriju aizsardziba pret vīrusu infekcijām CRISP-Cas CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) Cas (CRISPR-associated) genes, CRISPR-based adaptive immune systems Terns and Terns, 2011

Jaunās pieejas genoma modifikācijai CRISP-Cas Mali P. et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas 9. Science, V 339, p. 824, 2013

Vīrusu ģenētika Transfekcija Proteīna neaizsargāta vīrusa ģenētiskā materiāla nogādāšana šūnā (elektrošoks, liposomas, hidroksilapatīts) Transdukcija Gēna pārnese ar vīrusa palīdzību Specifiskā (l fāgs, gal, bio operoni) Nespecifiskā (P 2 fāgs, 40 -50 kbp. genoma fragmenti)

Vīrusu ģenētika Virulence / Lizogēnija l – fāga replikācijas stratēģiju izvēle

Vīrusu ģenētika Virulence / Lizogēnija

Vīrusu ģenētika Lambda (l) fāga ģenētiskā karte http: //biology. bard. edu/ferguson/course/bio 404/Lecture_08. pdf

Vīrusu ģenētika Virulence / Lizogēnija

DNS bibliotēku veidošana fāgu vektoros http: //kkk. gobot. com/genomicli brary. gif

Vīrusu ģenētika Virulence / Lizogēnija l infekcijas agrīnie posmi : 1. adsorbcija pie šūnas receptora (maltozes transporta proteīns); 2. DNS injekcija, cos secību - lipīgo galu savienošanās un ligēšana; 3. transkripcija – nekavējoši agrīnie, novēloti agrīnie, vēlīnie gēni; 4. replikācija – vispirms , pēc tam ripojošā gredzena mehānisms, specifiska šķelšana cos sekvencēs, lipīgo galu atdalīšanās, fāga savākšanās ; 5. baktērijas šūnas lizēšana.

l fāga cos saita nukleotīdu secība

Lambda (l) fāga replikācija DNS replikācijas teta ( ) mehanisms

Vīrusu ģenētika Agrīnā infekcijas stadija - izšķiršanās 1. Vāja transkripcija no PL un PR. Veidojas antiterminācijas proteīns N, kas mijiedarbojas ar RNA polimerāzi un sekmē transkripciju abos virzienos. Veidojas regulācijas proteīns Cro, kas sekmē ranskripciju no PR 2. N sekmē CIII (CII stabilizētājs) {PL}; kā arī CII, (CI stimulators) O, P, (DNA sintēze, mehanisms) Q gēnu transkripciju {PR}

Vīrusu ģenētika Agrīnā infekcijas stadija - izšķiršanās

Vīrusu ģenētika Agrīnā infekcijas stadija - izšķiršanās

Vīrusu ģenētika Izvēle - integrācija

Vīrusu ģenētika Izvēle - integrācija LIZOGĒNIJA. CII aktivē PRE (CI sintēzes sākums) un PI (integrāze). Veidojas CI, kas izspiež Cro no PL un PR, aktivē PRM Int sekmē att. P un att. B mijiedarbību un fāga DNS saplūšanu ar baktērijas DNS.

Vīrusu ģenētika Izvēle - integrācija

Vīrusu ģenētika Izvēle - integrācija l fāga att saita nukleotīdu secība

Vīrusu ģenētika Izvēle - integrācija

Vīrusu ģenētika Izvēle - integrācija

Vīrusu ģenētika Gēnu ekspresija profāgā

Vīrusu ģenētika Izvēle - integrācija Lizogēnas šūnas: • Satur l fāga genomu integrētu hromosomā, neaktīvā stāvoklī. PROFĀGS • Ir imūnas pret infekcijām ar radniecīgiem fāgiem. • Profāgu iespējams aktivēt ar dažādu faktoru (UV, mutagēni, nelabvēlīgi vides apstākļi).

Vīrusu ģenētika Indukcija

Vīrusu ģenētika Izvēle – litiskais cikls

Vīrusu ģenētika Izvēle – litiskais cikls LIZE. Ja Cro ir pietiekami daudz, tiek bloķēta CI sintēze (vispirms), bet vēlāk arī PL un PR kopumā. Izšķirošs kļūst transkripts no PR’ sadarbībā ar Q antitermināciju, kas palaiž fāga apvalku un lizes proteīnu sintēzi. DNS sintēze pāriet no � uz ripojošā gredzena mehanismu.

Lambda (l) fāga replikācija DNS replikācijas ripojošā gredzena mehanisms

ĢENĒTISKAIS SLĒDZIS

ĢENĒTISKAIS SLĒDZIS O 1, 2, 3 sekvences ir līdzīgas, bet nav identiskas; CI saistība ir vislabākā ar O 1, visvājākā – ar O 3. Cro – vislabākā ar O 3. Kopumā CI saistas ar operatora saitiem apm. 5 reizes efektīvāk nekā Cro

ĢENĒTISKAIS SLĒDZIS

Citi E. coli lizogēnie fāgi • l fāgam līdzīgie – fāgi 21 f 80, 82, 424, 434, krustimunitāte; • P 1, lielākais lizogēnais fāgs, 97 kbp. DNS, reti integrējas – vairāk sastopams plazmīdas veidā, Cre proteīns un rekombinācija lox. P saitā, 40% DNS piepildījums nepieciešams agregācijai, nespecifiskā transdukcija; • Mu, 42 kbp. DNS, fāga genoma galos – baktērijas skvences, efektīvs transpozons, mutāciju inducēšana; • P 2, 33, 2 kbp. DNS, apm. 10 integrācijas vietas baktērijas genomā, lizē reti. P 2 kodētos kapsīda proteīnus var izmantot P 4 (11 kpb. DNS), kas šūnās bez P 2 ir daudzkopiju plazmīdas formā.

Vīrusu ģenētika Transdukcija Gēna pārnese ar LIZOGĒNA vīrusa palīdzību Specifiskā (l fāgs, gal, bio operoni) Nespecifiskā (P 1, P 22 fāgi, 40 -50 kbp. genoma fragmenti)

SPECIFISKĀ TRANSDUKCIJA

SPECIFISKĀ TRANSDUKCIJA

NESPECIFISKĀ TRANSDUKCIJA

NESPECIFISKĀ TRANSDUKCIJA

NESPECIFISKĀ TRANSDUKCIJA

NESPECIFISKĀ TRANSDUKCIJA http: //bio. classes. ucsc. ed u/bio 105 l/EXERCISES/P 1 /masters. pdf