Virus recombinant et vaccination Exemple de la rage
Virus recombinant et vaccination Exemple de la rage FLICOTEAUX Pascal GARCON Sylvain
Rhabdovirus 4 RNA monocat-, 11 -15 Kb 4 Une seule glycoprotéine: G
Principe 4 Le but est d’insérer le gène codant pour la glycoprotéine rabique dans un virus (virus de la vaccine) 4 L’ensemble est injecté, la glycoprotéine est exprimée immunisation
Préparation de l’insert 4 Etape 1: excision de la queue polyd. G ATG TAC ATG Oligonucléotide double brin TAC ATG= codon initiateur
Préparation de l’insert 4 Etape 2: correction de l’aa n° 8 ATG CTA TAC GAT CCA GGT ATG TAC CCA GGT Hind III
Préparation du plasmide tk ADN viral Hind III Gène Thymidine kinase tk clonage
Préparation du plasmide tk + Promoteur précoce tk insert + Tk Hind III
Production de virus recombinant Ca 2+ Insert Géne nts Virus vaccinal ts Ts = thermosensible, nts = non ts Culture de cellule
Sélection des recombinants 4 Incubation à température non permissive Recombinants Culture de cellule
Sélection des recombinants 4 Culture sur cellules tk - Recombinants et tk- Culture de cellule + Brd. Urd = substrat tk
Vérification 4 Digestion ADN par Hind III 4 Electrophorèse: – 2 fragments (1, 1 + 5, 5 Kb): OK – Si 1 fragment (4, 6 Kb): non recombinant 4 Southern blotting: hybridation avec DNA de la glycoprotéine rabique
Préparation du plasmide tk + Promoteur précoce tk insert + Tk Hind III
Essais in-vitro 4 Infection cellules tk 4 Forte immunofluorescence avec des Ac anti- gp 4 La synthèse est donc efficiente 4 Immunoprécipitation: par sérum polyclonal autant que par 2 Ac monoclonaux (bande à PM de 66000: correspond à la glycoprotéine rabique)
Essais in-vivo 4 Injection intra-dermique chez la souris: résiste à des épreuves d’infection à haute dose
Conclusion 4 La glycoprotéine produite est qualitativement indistingable de la protéine native 4 Les virus atténués comme le virus vaccinal sont des vecteurs particulièrement appropriés pour la production de vaccins (à été utilisé pour smallpox, hépatite B, influenza et herpès)
Biblio 4 Kieny M. P. et al. , 1984 : expression of rabies virus glycoprotein from a recombinant vaccinia virus. Nature, 312, 163 -166 4 Blancou J. et al. , 1986 : oral vaccination of the fox against rabies using a live recombinant vaccinia virus. Nature, 322, 373 -375 4 Pastoret P. P. & Brochier B. , 1996: the developement and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur. Epidemiol. Infect. , 116, 235 -240
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