Virus dellepatite B HBV fam Hepadnaviridae diffusione mondiale

Virus dell’epatite B (HBV, fam. Hepadnaviridae): • diffusione mondiale, prevalentemente asintomatico, letalità 1% • cronicizzazione 5 -10% casi cirrosi epatica e/o epato-carcinoma • epidemiologia: • ½ della popolazione mondiale ha contratto HBV • 350 milioni malati cronici • 2% della popolazione in America-Europa, 10 -25% in Asia-Africa • propagazione: sangue, liquidi biologici • si replica solo nell’uomo e nello chimpanzee

STRUTTURA DELLA PARTICELLA VIRALE HBV Particella sferica (40 -50 nm) proteica (particella Dane) contenente il genoma virale (DNA doppio filamento parziale, 3. 2 kbp) DNA virale clonato e amplificato in E. coli Espressione dei geni virali in E. coli per la produzione di vaccini senza successo: • prodotto proteico instabile e degradato • prodotto proteico dannoso per l’ospite?

Scopo del lavoro: Espressione dei geni virali a partire dal promotore regolato della fosfatasi acida P-60 di lievito: • basso fosfato inorganico induzione • alto fosfato inorganico repressione • fusione ‘pulita’ promotore-gene Miyanohara A et al. Expression of hepatitis B surface antigen gene in yeast (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1 -5

COSTRUZIONE del VETTORE p. AM 82 Hogness box (TATA box) Capping (RNA) ATG (protein) Sal I digestione Bal 31 inserzione polilinker Xho I ligazione Hogness box (TATA box) Capping (RNA) Xho I

MAPPA DEI VETTORI DI ESPRESSIONE p. AH 203 e p. AH 301 Hogness box (TATA box) Capping (RNA) Xho I Bam HI HBs. Ag Hogness box (TATA box) Capping (RNA) Xho I HBc. Ag Xho I (Bam HI) HBs. Ag Trasformazione AH 22 (selvatico, regolato ) e AH 22 pho 80 (mutante costitutivo) selezione leu+

Saggio di reattività immunologica 1. Crescita dei trasformanti 2. Sospensione delle cellule in basso fosfato (induzione) a 1. 5 x 107 cell/ml 3. Lisi parete cellulare (zymoliase) 4. Lisi sferoplasti (triton X-100) 5. Estrazione e purificazione proteine solubili (centrifugazione) 6. Analisi estratti (50 g proteina) con test immuno-radiochimici (anticorpi marcati) 7. Curva standard con HBs. Ag da siero umano (ipotesi che i due antigeni – umano e da lievito – reagiscano similmente) • Solo i trasformanti producono attività antigenica • La produzione è sotto il controllo trascrizionale del fosfato • L’ assenza di HBc. Ag non altera la produzione

Caratteristiche di produzione: 1. I trasformanti sono stabili (test su 6 generazioni) 2. La produzione è di 5 x 105 molecole di HBs. Ag per cellula 3. Le molecole si assemblano in particelle sferiche da 20 -22 nm 4. Le particelle NON CONTENGONO DNA VIRALE

Attività immunogenica delle particelle di lievito: 1. Preparazione degli estratti da lievito 2. Iniezione sottocutanea in cavie 3. Misura dell’attività anticorpale anti HBs. Ag nel siero delle cavie: positivo, le particelle sono IMMUNOGENICHE 4. Controllo con particelle virali da siero umano 5. Misura dell’attività anticorpale anti HBc. Ag, HBe. Ag: negativo