VIROLOGIE I Lkask mikrobiologie cvien jarn semestr 2018
VIROLOGIE I. Lékařská mikrobiologie – cvičení, jarní semestr 2018 Mikrobiologický ústav LF MU http: //www. fbs. leeds. ac. uk
Osnova �Viry – úvod �Stavba virové částice �Klasifikace virů �Viry hepatitid �Virus HIV �Diagnostika virových hepatitid a HIV �Herpesviry
Viry (1) �Na pomezí mezi živými a neživými organismy. �Schopny přežívat pouze v hostitelském organismu intracelulární parazité, chybí jim proteosyntetický aparát. �Nebuněčné organismy, bez cizí „pomoci“ nerostou, nedělí se, nejsou schopny samostatně vyrábět energii ani syntetizovat makromolekuly. �Vykazují vlastnosti živých systémů – schopnost adaptace, obsahují svůj vlastní genom.
Viry (2)
Dělení virů �Mnoho možných parametrů: q DNA vs. RNA q jednovláknové (ss) vs. dvouvláknové (ds) q obalené vs. neobalené q tvar kapsidy (kubická, helikální, . . . ) q přítomnost reverzní transkriptázy �V praxi se často používá Baltimorova klasifikace virů – 7 tříd.
Baltimorova klasifikace virů http: //viralzone. expasy. org
Stavba viru (1) �Virion = jedna virová částice �Kapsida = bílkovinné pouzdro, plášť, chrání NK a určují tvar virionu �Kapsomera = morfologická jednotka sdružující strukturální podjednotky a tvořící kapsidu �Virový genom = nukleová kyselina �Nukleokapsida = strukturní útvar skládající se z virové NK a kapsidy �Jednotlivé proteinové jednotky se k sobě spojují autoagregací (proces probíhající bez dodání energie).
Stavba viru (2) �Obal – přítomen pouze u některých virů. Složen z lipidové dvojvrstvy a transmembránových glykoproteinů. glykoproteiny ve formě výběžků na porchu viru = peplomery (spikes) q slouží k přichycení viru k hostitelské buňce q
Symetrie virové kapsidy �Ikosahedrální (kubická) = dvacetistěn se třemi osami symetrie (2 -, 3 -, 5 -četnou) �Helikální (šroubovicová) = jednotlivé polypeptidy (protomery) se řadí za sebou a jako šroubovice sledují vlákno genomu �Komplexní = uspořádání kapsomer neumožňuje jednoznačné zařazení do předchozích skupin http: //panurgybiotech. blogspot. co. uk
Viry hepatitid � 5 hlavních typů virových hepatitid – VHA, VHB, VHC, VHD a VHE (každý patří do jiné virové skupiny)
Hepatitis A virus �Neobalený, http: //viralzone. expasy. org +ss. RNA, 30 nm
Hepatitis B virus �Obalený, http: //viralzone. expasy. org částečně ds. DNA (RT), 42 nm
Hepatitis C virus �Obalený, http: //viralzone. expasy. org +ss. RNA, 50 nm
Hepatitis D virus �Obalený, -ss. RNA, 22 nm �satelitní virus (vyžaduje koinfekci s HBV) http: //viralzone. expasy. org
Hepatitis E virus �Neobalený, http: //viralzone. expasy. org +ss. RNA, 32 -34 nm
Hepatitidy �Infekční záněty jater, lidově žloutenky �Pojem hepatitida: 1) 2) přenosné virové onemocnění Příznak, ktreý je přítomen nejen při virové hepatitidě, ale také např. při obstrukci žlučových cest. �nevirové hepatitidy q Metabolická (Wilsonova choroba) – abnormální střádáním mědi v játrech poškození jaterních buněk, poruchy funkce CNS a hemolytickou anémii; porfyrie = hromadění prekursorů hemu v játrech) q Toxická (alkohol, léky)
Hepatitidy – příznaky �Ikterická forma (zežloutnutí), ale běžnější je u všech hepatitid forma anikterická.
Prevence hepatitid �Očkování proti hepatitidě A je dostupné a doporučené např. i při cestách do jižní Evropy či severní Afriky �Očkování proti hepatitidě B je nyní součástí normálního očkovacího kalendáře (hexavakcína) �možné současné očkování proti hepatitidě A i B �Očkování proti hepatitidě C není (několik genotypů, velké množství subtypů, snadno mutuje) �Očkování proti hepatitidě D = proti HBV �Experimentální vakcíny proti HEV (různé fáze klinických studií, uvedení na trh zřejmě nebude v dohledné době)
Screening a léčba hepatitid �Screening hepatitidy B běžný (před operacemi, v těhotenství apod. ). �Léčba akutních hepatitid je symptomatická a podpůrná. �Základem terapie klidový dietní režim, použití hepatoprotektiv. �VHC – časná léčba interferonem může zabránit přechodu do chronicity. �Antivirotika: lamivudin (HBV).
Virus HIV �Retrovirus (reverzní transkriptáza) �HIV 1 – ve střední Africe a v ostatních kontinentech, kam se rozšířil �HIV 2 – pouze v západní Africe, rozvoj onemocnění je �pomalejší než u infekce HIV 1 �přenos se krví, pohlavní cestou, z matky na dítě (transplacentárně i mateřským mlékem)
Infekce virem HIV � primoinfekce virem HIV (težký pokles CD 4+ lymfocytů, přechodná virémie, příznaky podobné jako tonsilofaryngitida, infekční mononukleóze či chřipce) � bezpříznakové stádium (18 měsíců až 15 let, perzistující generalizovaná lymfadenopatie) � časné symptomatické stádium (celkové příznaky – horečka nad 38, 5° C, noční pocení, únava, úbytek na váze; časté malé oportunní infekce � pozdní symptomatické stádium, AIDS (konečné stadium HIV infekce, velké oportunní infekce, nádory, encefalopatie)
Virion HIV �Obalený, dvě kopie +ss. RNA, 80 -100 nm
Herpesviry (1) �Obalené, ds. DNA, ikosaedrální symetrie �Typické je pro ně přetrvávání v latentní fázi v organismu, především v nervové a lymfatické tkáni �Z latentní fáze možná reaktivace, nejčastěji vlivem stresu či oslabeného imunitního systému
Herpesviry (2) �Obalené, 200 nm lineární ds. DNA, poměrně velké 150 –
Detekce virové infekce �přímé metody q mikroskopie – u virů obtížná, viz J 11 q kultivace – u virů obtížná, viz J 11 q biochemické metody – u virů se nepoužívají q průkaz antigenu (pomocí protilátky) q pokus na zvířeti (izolace, průkaz toxicity) q průkaz nukleové kyseliny �nepřímé metody q průkaz protilátek (pomocí antigenu) – KFR, HIT, VNT, ELISA
Herpesviry (3) Virus Zkratka Nemoc Hlavní přímé metody Hlavní nepřímé metody Herpes simplex virus (typ 1 a 2) Varicella zoster virus HSV 1, 2 Opar rtu Genitální opar VZV ELISA a další reakce se značenými protilátkami (různé třídy protilátek, případně i různá avidita) Epstein-Barrové virus Cytomegalovirus Lidské herpesviry 6 a 7 EBV 1) plané neštovice 2) pásový opar Infekční mononukleóza Cytomegaloviróz a Exanthema subitum čili roseola infantum Podíl na Kaposiho sarkomu (u HIV +) Kultivace na buněčných kulturách, PCR Zejména PCR, jen výjimečně kultivace na buněčných kulturách (VZV) Lidský herpesvirus 8 CMV HHV 6, 7 HHV 8
Herpes simplex virus �I po zaléčení infekce viry přetrvávají v latentní fázi v nervových gangliích �HSV-1: herpes labialis (puchýřky na sliznicích, nejčastěji na rtu) q závažné komplikace (encefalitida, infekce oka) �HSV-2: herpes genitalis (puchýřky v oblasti genitálu a řitního otvoru) �Diagnostika: klinické příznaky, PCR, popř. izolace viru �Léčba: aciklovir, valaciklovir a famciklovir (nepůsobí na latentní infekci, infekce nejsou vyléčitelné latence)
Varicella zoster virus �Vstup infekce: respirační trakt, poté dojde k pomnožení viru v lymfatických uzlinách dojde k rozsevu do kůže a tvorbě pochýřků na sliznicích (plané neštovice) �Perzistence: ve spinálních gangliích interkostálních nervů �Reaktivace: oslabené imunita nebo stres šíření do senzitivní oblasti příslušného nervu (pásový opar) �Diagnostika: PCR, ELISA, popř. kultivace �Léčba: aciklovir, valaciklovir a famciklovir
Cytomegalovirus �Vstup infekce: respirační nebo trávicí trakt, poté dojde k pomnožení viru hematogenní rozsev �Perzistence: slinné žlázy, renální tubuly, leukocyty �Infekce většinou bezpříznaková, závažné pouze u těhotných žen (dochází k infekci plodu) a u imunokompromitovaných �Diagnostika: serologie, PCR, kultivace �Léčba: ganciklovir, foskarnet
Lidský herpesvirus 6 + 7 �HHV-6 A, HHV-6 B, HHV-7 �Infekce u dětí nejčastěji do jednoho roku života �Přenos: kontaktem poté zvýšená teplota někdy doprovázená vyrážkou (exanthema subitum/roseola infantum) �Reaktivace: bezpříznaková (příznaky pouze u imunokomromitovaných jedinců) �Diagnostika: klinické příznaky, serologie, izolace viru �Léčba: symptomaticky, ganciklovir
Virus Epstein-Baarové �Vstup infekce: respirační trakt pomnožení v B -lymfocytech bezpříznakově nebo angína s lymfadenitidou (= infekční mononukleóza), až po postižení jater �Pro-onkogenní infekce �Diagnostika: Paul-Bunnellova reakce (důkaz heterofilních protilátek shlukujících beraní krvinky) nebo průkaz specifických protilátek proti různým virovým antigenům (EBNA, VCA) �Léčba: symptomaticky
Protilátky anti-EBNA a anti-VCA �EBNA = EBV nukleární antigen q Neobjevují se v akutní fázi, ale až 2 – 4 měsíce po začátku příznaků. q Perzistují po zbytek pacientova života. �VCA = virový kapsidový antigen q anti-VCA Ig. M: Objevují se v akutní fázi infeke, mizí během 4 – 6 týdnů. q anti. VCA Ig. G: Objevují se v akutní fázi infekce, vrcholí 2 – 4 týdny po začátku nemoci, klesají pomalu a přetrvávají po zbytek pacientova života
Lidský herpesvirus 8 �HHV 8 �Velké množství genů pocházejících z hostitelské buňky �Pro-onkogen Kaposiho sarkom (tvorba lézí na těle), zvláštní typ nádoru u pacientů s AIDS �Diagnostika: zatím spíše experimentální
Diagnostika hepatitid A, C, D, E �HAV: stanovujeme metodou ELISA anti-HAV Ig. M s Ig. G, nebo Ig. M a celkové protilátky �HCV: stanovujeme Ig. M a Ig. G protilátky metodou ELISA, dále se používá PCR �HDV: prokazuje se delta antigen (HDAg), protilátky (anti-HD) či virová RNA pomocí PCR �HEV: průkaz Ig. M a Ig. G protilátek metodou ELISA, ve výzkumu i PCR
Diagnostika hepatitidy B (1) �Nukleokapsida – dvě dřeňové bílkoviny, které mají povahu antigenů (HBc. Ag a HBe. Ag) �Obal – antigen HBs. Ag je nadprodukován (v krvi kolují i prázdné obaly) �Do prázdného HBs. Ag může proniknout delta agens – původce hepatitidy D �Delta agens podstatně zhoršuje prognózu virové hepatitidy.
Diagnostika hepatitidy B (2) �HBV má tři pro diagnostiku významné antigeny. Jen dva z nich však nalézáme v séru: HBs. Ag a HBe. Ag. �HBs. Ag se tvoří v nadbytku, takže je ho vždy v séru hodně, proto se hodí pro screening. �Protilátky naopak můžeme stanovovat proti všem třem z nich: anti-HBs, anti-HBe i anti-HBc. �Diagnostiku případně doplní PCR, průkaz jaterních enzymů aj. �Z kombinace vyšetření plyne interpretace.
Diagnostika HIV �Protilátky proti obalovým glykoproteinům pomocí ELISA testů (gp 41, gp 120). �Výsledek vyjde jako pozitivní, pošle se vzorek séra do referenční laboratoře, která výsledek ověří další reakcí ELISA a Western blottem. �Do výsledků konfirmace je výsledek hodnocen jako „reaktivní“, nikoli jako „pozitivní“. �Přímý průkaz lze provádět pomocí PCR. ● �Izolace viru je dnes již možná, ale velmi náročná a běžně se neprovádí.
Úkol 1: Diagnostika HAV �úkol 1 a: stanovujeme anti-HAV Ig. M �úkol 1 b: stanovujeme celkové protilátky anti. HAV (Ig. M + Ig. G + ostatní) �výpočet cut off: q průměr „c. o. “ důlků C 1 a D 1 = cut off q hodnoty 110 % cut off a více = pozitivní q hodnoty 90 % cut off a méně = negativní q hodnoty 90– 110 % cut off = hraniční �stanovení Ig. M + celkových protilátek je alternativou ke stanovení Ig. M a Ig. G
Úkol 2: Diagnostika HBV � úkol 2 a + b: stanovení HBs. Ag a HBe. Ag � úkol 2 c + d: stanovení anti-HBs a anti-HBe � výpočet cut off: průměr C 1 a D 1 hodnoty 110 % cut off a více = pozitivní q hodnoty 90 % cut off a méně = negativní q hodnoty 90– 110 % cut off = hraniční q � HBs. Ag (přítomnost viru v organismu v jakémkoli období infekce � HBe. Ag (vylučována pouze během replikace viru) � anti-HBs (po prodělané infekci nebo očkovaní) � anti-HBe (po prodělané infekci)
Úkol 3: Diagnostika HCV �úkol 3 a: PCR, elektroforéza �úkol 3 b: průkaz anti-HCV metodou ELISA �výpočet cut off: průměr negativních kontrol (důlku B 1, C 1 a D 1) + 0, 050 q hodnoty 110 % cut off a více = pozitivní q hodnoty 90 % cut off a méně = negativní q hodnoty 90– 110 % cut off = hraniční
Úkol 4: Indicie � Pacient C – ikterický stav trvá několik týdnů, přetím potíže neměl � Pacient D – ikterický stav již přetrvává několik let, ale neřešil to � Pacient E – ultrazvuk ukazuje přítomnost útvarů v oblasti žlučníku. Urobilinogen negativní, stolice acholická � Pacient G – z anamnézy: před deseti dny byl v kontaktu s kamarádem, u kterého se později potvrdila virová hepatitida A � Pacient H – u pacienta snížená sérová hladina ceruloplasminu a zvýšené vylučování mědi močí. Přítomna též anémie a neurologické projevy
Úkol 4: Souhrn výsledků
Úkol 4: Závěr � A: akutní hepatitida A � B: akutní hepatitida C � C: akutní hepatitida B � D: chronická (neaktivní) hepatitida B; v dětství prodělal VHA (nebo je očkován) � E: současný ikterus zřejmě způsobily kameny; také on kdysi asi prodělal VHA � F: původ současné žloutenky nejasný, nutno vyšetřovat dále; prodělal VHB, vyléčen � G: příliš čerstvá hepatitida A, ještě nemá vytvořeny protilátky � H: Wilsonova choroba (nejde o infekci)
Úkol 5: Vyšetření protilátek anti. HIV metodou ELISA �výpočet cut off: q průměr „c. o. “ důlků C 1 a D 1 = cut off q hodnoty 110 % cut off a více = pozitivní q hodnoty 90 % cut off a méně = negativní q hodnoty 90– 110 % cut off = hraniční �v ČR registrujeme cca 2500 HIV pacientů
Úkol 6: Diagnostika virů čeledi Herpesviridae Virus Zkratka Nemoc Hlavní přímé metody Hlavní nepřímé metody Herpes simplex virus (typ 1 a 2) Varicella zoster virus HSV 1, 2 Opar rtu Genitální opar VZV ELISA a další reakce se značenými protilátkami (různé třídy protilátek, případně i různá avidita) Epstein-Barrové virus Cytomegalovirus Lidské herpesviry 6 a 7 EBV 1) plané neštovice 2) pásový opar Infekční mononukleóza Cytomegaloviróz a Exanthema subitum čili roseola infantum Podíl na Kaposiho sarkomu (u HIV +) Kultivace na buněčných kulturách, PCR Zejména PCR, jen výjimečně kultivace na buněčných kulturách (VZV) Lidský herpesvirus 8 CMV HHV 6, 7 HHV 8
Úkol 7: Praktická diagnostika infekční mononukleózy �Detekce specifických protilátek: q EBNA – nukleární Ag, ne u čerstvých infekcí, ale u latence a reaktivace q VCA – kapsidový Ag, u čerstvých infekcí Ig. G anti-VCA Ig. M anti-VCA Ig. G anti-EBNA Vnímavý jedinec (dosud neinfikován) negativní Běžný nález (kontakt v minulosti, zpravidla pozitivní negativní pozitivní/negati pozitivní negativní pozitivní s následkem latence) Akutní primární infekce vní Reaktivace (případně některé akutní primární infekce) pozitivní
Po tomto cvičení byste měli: �Popsat stavbu virionu. �Zhodnotit postavení virů mezi organismy (společné/rozdílné znaky s živými organismy, charakteristické vlastnosti virů). �Znát původce virových hepatitid a rozdíly mezi nimi. �Popsat virus HIV a cesty nákazy. �Být schopni vyhodnotit výsledky laboratorních vyšetření hepatitid a HIV.
- Slides: 47