Viral Hastalklarda Tan Yntemleri Prof Dr Mehmet KIYAN

Viral Hastalıklarda Tanı Yöntemleri Prof. Dr. Mehmet KIYAN

Viruslar Ø Zorunlu hücre içi paraziti Ø Büyüklük: 18 -26 nm / 300 nm Ø Nükleik asit + Kapsid ( + Zarf )

Laboratuvar Yöntemleri § § Virusların izolasyon ve identifikasyonu Nükleik asit tayini Viral komponentlerin (proteinler=antijenler) saptanması Serolojik yöntemler https: //www. torch. ro/en/medicine-everybody/what-methods-of-diagnosis-we-can-use-for-infections-viral/

Virüsün üretilmesi (izolasyon) • Virüsler yapay besiyerlerinde üreyemezler. Hücre kültürlerinde veya başka bir canlı sistemde üretilmeleri gerekir. • Embriyonlu tavuk yumurtası • Hücre kültürleri (en sık) • Deney hayvanları • Virüs izolasyonu için farklı hücre kültürleri kullanılabilir. • Bir çok viral hastalığın tanısında etkenin izolasyonu altın standarttır. Ancak virüs izolasyonunun duyarlılığı moleküler tanı tekniklerine göre daha düşük ve daha zahmetlidir. • Bu nedenle bir çok virüs enfeksiyonunun laboratuvar tanısında kültür yöntemleri rutinde tercih edilmez.

Embriyonlu Tavuk Yumurtası

Hücre Kültür Tipleri • Primer hücre kültürü: Maymun böbreği, insan bebek sünnet dokularının hücrelere ayrıştırılmasıyla elde edilen üretilen kültürdür. • Sekonder (Diploid) hücre kültürleri: Primer hücre kültürlerinden hazırlananırlar. İlk pasajda orjinleri %75 oranında aynı karyotipdir. Pasajlar artıkça karyotiplerinde değişikliğe uğrarlar ve en fazla 50 pasaj sonra ölürler. • Sürekli hücre kültürleri: Bazı kanser veya transforme hücrelerden elde edilen sürekli pasajlarla uzun süre sürdürülen kültürlerdir. Bunlara heteroploid hücre kültürü de denir.

Histoloji / Sitoloji • Hücrede karakteristik sitopatik etki oluşturan virüslerde klinik örneklerin direkt boyalı mikroskobik (sitolojik) incelemesi hızlı tanı için yararlıdır. • Hücre morfolojisindeki değişimler; o o hücre lizisi, vakuolizasyon, sinsitya oluşumu inklüzyon cisimcikleri karakteristik sitopatik etkilerdir. Sitopatik etki (CPE

Sitopatik Etki Virüs replikasyonu genellikle enfekte hücre kültürlerinde görülen morfolojik değişiklikler veya sitopatik etkiler (CPE) ile tespit edilir. Şekil 1: 48 saatlik enfekte olmamış vero hücreleri (maymun hücreleri): • Her çekirdeğin içinde birkaç nükleol görülebilmekte • Hücreler, bazik bir boya olan hematoksilin ve asidik bir boya olan eozin ile boyanmıştır. • Eozinofilik sitoplazmaya (pembe) ve bazofilik çekirdeklere (mor) dikkat edin Şekil 2. Poliovirüs tip 1 ile enfekte Vero hücrelerinde özgül CPE: Belirgin şekilde https: //www. asmscience. org/content/education/i magegallery/image. 2617

Viral inklüzyon cisimcikleri Hastalık İnklüzyon cisimciğinin ismi Kuduz CMV Negri Baykuş gözü (Owl’s eye) Cowdry A Guarneri HSV, VZV Poks virüs Yerleşimi İntrasitoplazmik İntranükleer İntrasitoplazmik asidofilik İntranükleer bazofilik Adenovir üs Perinükleer sitoplazmik , asidofilik Kızamık İntrasitoplazmik ve intranükleer

Sitopatik etki oluşturmayan virüslerde tanı o o o Nötralizasyon testi İmmunofloresan (IF) testi Hemaglütinasyon inhibisyon testi Hemadsorbsiyon inhibisyon testi Kompleman birleşme testi

İmmün boyama (İmmunfloresan) • En sık kullanılan yöntemdir. • İmmün boyamada genellikle direk immün floresan (DFA) veya daha seyrek olarak indirek immünfloresan yöntemi kullanılır. • DFA hızlı sonuç vermesi, özgül ve uygulanmasının basit olması nedeniyle tercih edilen bir yöntemdir. https: //www. sciencedirect. com/topics/immunology-andmicrobiology/immunofluorescence https: //www. researchgate. net/figure/Directimmunofluorescence-procedure_fig 2_274679533

Elektron mikroskopi • Duyarlılığı düşük olduğu için rutin laboratuvar tanıda standart bir teknik değildir. • Virüsün saptanabilmesi için örneğin mililitresinde yaklaşık 106 viral partikülün bulunması gerekir. • İmmün-elektron mikroskopi: Mikroskopta incelenecek klinik örneğe araştırılan virüse özgül antikorlar eklenirse viral partiküllerin kümelenmesi sağlanarak virüs daha kolay saptanabilir.

Serolojik Yöntemler • Serolojik testler invitro antijen-antikor birleşmesi mekanizmasına dayanan immünolojik temelli yöntemler olduğundan bu testlerde temel amaç bilinmeyen bir reaktifi (ör: antikor) bilinen bir reaktif kullanarak (ör: antijen) saptamaktır. • İki temel amacı vardır: o Klinik örneklerde mikroorganizma antijeninin saptanması o Hasta serumunda etkene özgül antikor varlığının gösterilmesi

Viral antijenlerin saptanması • Viral antijenler viral proteinlerdir. • Bir antijenin immün yanıt mekanizmalarını uyaran ve immün yanıt ürünleriyle reaksiyona giren her bir kimyasal yapısına antijenik determinant (epitop) denir.

Antijen-Antikor Reaksiyonları • Presipitasyon • Aglütinasyon • Kompleman fiksasyon • Opsonizasyon • Nötralizasyon

saptanması İki klinik uygulaması vardır; 1) Primer (akut) enfeksiyonun tanısı (yeni geçirilen enfeksiyon o Etkene özgül Ig. M varlığı (Ig. G yokluğunda) Ø Ig. M pozitifliği primer enfeksiyonun özgül belirleyicisi değildir. Yanı Ig. M pozitifliği her zaman primer akut enfeksiyonu göstermez. Bunun dışında aşağıdaki durumlarda saptanabilir: Ø Sekonder enfeksiyonlar Ø Reenfeksiyon Ø Reaktivasyon v Uzun süren Ig. M yanıtı v Poliklonal B hücre aktivasyonu sonucu özgül olmayan Ig. M pozitiflikleri v Akraba mikroorganizmalarla 2) İmmünitenin belirlenmesi (geçirilmiş enfeksiyon, kazanılmış bağışıklık) o Etkene özgül Ig. G pozitifliği

Humoral İmmün Yanıtın Kinetiği • Bir antijen bir konağa ilk kez girdiğinde önce (5 -7 gün) Ig. M, sonra da (7 -15 gün) Ig. G antikor cevabı oluşur. Ig. M genellikle bir süre sonra (3 -6 ay) kaybolur, ancak Ig. G düzeyi azalarak da olsa uzun süre serumda kalır. Buna primer immün yanıt denir. • Aynı konak aynı antijenle aylar / yıllar sonra ikinci kez tekrar karşılaştığında; bu kez özgül Ig. G yanıtı çok daha hızlı ve yüksek düzeyde oluşurken Ig. M cevabı oluşabilir veya oluşmayabilir (sekonder immün yanıt). • Serokonversiyon enfeksiyonun akut ve konvelasan dönemlerinde (10 -14 gün arayla) hastadan alınan iki serum örneği arasında Ig. G veya total antikor düzeyinin 4 kat veya daha fazla artış göstermesiyle karakterizedir. • Dolayısıyla bir etkene özgül Ig. M ve Ig. G birlikte pozitif

Avidite ve Avidite olgunlaşması • Bu testlerin yapılması, etkene özgül Ig. G ve Ig. M birlikte pozitif ise endikedir. • Ig. G avidite testleri için gerekli en önemli şart, etkene özgül Ig. G’nin pozitif olmasıdır. • Primer enfeksiyonlarda etkene özgül Ig. G aviditesi düşük iken sekonder enfeksiyonlarda yüksektir. Zaman ilerledikçe bu antikorlar olgunlaşır ve aviditesi artar (avidite olgunlaşması). • Bunun nedeni yüksek aviditeye sahip antikor üreten B lenfosit populasyonunun seçilmiş olmasıdır. • Dolayısıyla sekonder immün yanıtta, seçilmiş bellek B lenfositleri tarafından aviditesi yüksek antikorlar sentezlenir.

Avidite Testlerinin Klinik Kullanımları • Bazı hasta gruplarında avidite testleri tanı, tedavi ve prognoz açısından önem taşır. • Primer enfeksiyonlarda viremi riski artmış olup sıklıkla hastalığın semptomatik olarak geçirilmesi söz konusudur. • Örneğin; hamileliğin ilk trimesterinde geçirilen primer TORCH enfeksiyonlarında konjenital geçiş riski %15’ten fazla iken, sekonder enfeksiyonlarda bu risk % 1’den azdır ve geçiş olsa bile bebekte malformasyon gelişme riski % 0. 1’dir.

Avidite Testlerinin Klinik Kullanımları • Hamilelik sırasında Rubella, CMV ve Toxoplasma gondii enfeksiyonlarının primer yada sekonder olduğunun belirlenmesi için • Organ transplantasyonlu yada immün supresif hastalarda CMV, EBV, HHV-6, primer veya rekürren enfeksiyonlarının ayırt • Hepatit C virüs enfeksiyonlarında primer özgül antikor yanıtı ile pasif olarak kazanılmış antikorların ayırt edilmesi • HIV enfeksiyonlarında bulaş zamanının belirlenmesi ve progresyon izlenmesi • Otoimmün hastalıkların tanısı • Viral ensefalitlerin multipl sklerozdan ayırt edilmesi • Aşı çalışma ve

Geleneksel serolojik testler • Kompleman birleşmesi deneyi, • Nötralizasyon, • Hemaglütinasyon inhibisyonu, • Pasif aglütinasyon • Lateks aglütinasyon testleri geleneksel serolojik testler olarak bilinirler.

Lateks aglütinasyon testleri • Kan grubu tayini

Hemaglütinasyon n n Bazı viruslar çeşitli insan ve hayvan eritrositleri ile karşılaştıkları zaman süspansiyon halinde bulunan eritrositleri birbirlerine yapıştırarak çöktürürler Bu antijen antikor birleşmesi olayı DEĞİLDİR Eritrositler Virüsler Hemaglütinasyon

Direk Hemaglütinasyon • Bu yöntem bazı enfeksiyonlarda eritrosit yüzeyindeki antijenlere karşı doğal olarak oluşan antikorların tespitinde kullanılır. • Örneğin EBV akut enfeksiyöz mononükleozisinde koyun eritrositlerini aglütine eden heterofil antikorlar gibi (Paul-Bunnel testi). • Bu testler hızlı tanı için yararlı olmalarına rağmen

İnhibisyon Testi • Bazı virüsler doğal olarak bazı hayvan eritrositlerinin yüzey reseptörlerine bağlanarak onları aglütine etme yeteneğindedirler. • Hasta serumunda virusa karşı antikor varlığı araştırılır • Yöntemin esası; hasta serumunda virusa karşı antikor varsa bunların virus partiküllerine bağlanması virusun hemaglütinasyonunun engellenmesi temeline dayanır • Bu özellikten yararlanarak hemaglütinaston yapan virüslere karşı özgül antikor varlığının araştırılmasında hemaglütinasyon önlenim testi kullanılır. Örnek; o Kabakulak o Rubella o Arbovirüsler Eritrositl er Virüsler Hemaglütinasy on Tüp dibinde eritrositler küme şeklinde toplanır Paramiksovirüsler Serumdaki Virüsler nötralize Eritrositler İnfluenza edilir, viral hemaglütinasyon antikorlar

Hemadsorbsiyon Önlenim Testi • Hemadsorbsiyon, bazı virüslerle enfekte olan hücrelerin yüzeylerine viral antijenler eksprese edildiğinden bazı hayvan eritrositlerini adsorbe etmesi (yapışması) olayıdır. • Genelde hemaglütinasyon yapan virüsler hemadsorbsiyon da yaparlar. • Bu olay özgül antikor varlığında önlenir ve canlı hücre kültürlerinde gerçekleşir.

İşaretli Katı Faz Yöntemleri • Hızlı yöntemler olarak bilinen bu testler serum örneğinde kısa zamanda o Özgül antikorların (Ig. G, Ig. M, Ig. A veya total) veya o Özgül antijenlerin saptanmasına olanak sağlar. • İşaretli katı faz yöntemlerinin ortak ve temel mekanizması reaktiflerden birisinin (antijen veya antikor) katı faza bağlanarak hareketsizleştirilmesi ve daha sonra özgül birleşmenin işaretli bir reaktif (konjugat) • İmmün testlerde katı-faz nedir? o Antijen (Ag) veya antikorın (Ab) katı bir materyale • plastik boncuklar, • polistiren mikrotüp kuyucukları • nitroselüloz / naylon membranlar bağlanmasıdır. • Antijen aranacaksa katı faza antikor bağlanır (Direkt) • Antikor aranacaksa, katı faza antijen bağlanır (İndirekt)

Özellikleri Yöntem İşaretleme maddesi Katı faz Değerlendirme Enzim immünoassay (ELISA, EIA) Enzim Mikropleyt çukurları, polistren bilyalar Spektrofotometre ile absorbans ölçümü Radioimmünoassay (RIA) Radyoaktif madde Tüpler ve cam bilyeler Gama sayacı ile radyoaktivite ölçümü İmmünfloresans antikor (IFA) Floresanlı boya Üzerine antijenlerin fikse edildiği lamlar Floresan mikroskobu ile parlak sarı-yeşil boyanmanın görülmesi Kemilüminesans Biolüminesan madde Manyetik Luminometre ile ışık salınımının partiküller, ölçümü mikropleyt çukurları Line immünoassay Enzim Antijen emdirilmiş özel şeritler Görsel olarak koyu renkli bant oluşumunun izlenmesi Membrana bağlı immünoassay (kaset testleri) Enzim Nitroselüloz, naylon membranlar Görsel olarak koyu renkli nokta veya çizgi oluşumu

Enzim Bağlı Immunosorbent Assay (ELISA, EIA) • Enzim ile işaretlenmiş konjugatın kullanıldığı yöntemler ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) olarak adlandırılırlar. • ELISA yöntemlerinde kullanılan katı faz, genellikle çukurlarına antijen veya antikorun bağlanmış olduğu 96 çukurlu https: //www. sinobiological. com/category/what-is-elisamikroplate’lerdir. mechanism

ELISA ile antikor tespiti • Mikroplate çukurlarına özgül antijen bağlanır. Çukurlara hasta serumu dilüsyonları eklenir. • Hasta serumunda özgül antikor (Ig. G veya Ig. M) varsa antijenle birleşir. • İnkübasyon ve yıkama işleminden sonra hangi tip antikor araştırılıyorsa ona özgül konjugat eklenir. • Ardından kromojenik substrat eklenir. • Reaksiyon sonucu hasta serumundaki antikor miktarı ile doğru orantılı oluşan renk değişikliği spektrofotometrik olarak

ELISA ile antijen tespiti • Özgül antikorlar katı faza bağlanarak klinik örneklerden viral antijenler saptanabilir. • Hasta örneğindeki viral antijenler katı fazdaki antikora bağlanır. • Ardından teste katı fazdaki antikorla aynı özgüllüğe sahip antiviral antikorlar ve enzimle işaretli anti human globulin (AHG) eklenir. • Eğer antijen katı fazdaki özgül antikora ve eklenen ikinci antiviral antikora • Son aşamada ortama eklenen kromojenik substrat AHG’ye bağlı durumda bulunan enzimle parçalanır ve oluşan renk değişikliği spektrofotometreyle saptanır. • Bu amaçla en yaygın olarak hepatit B yüzey antijeni ve hepatit C kor antijeni saptayan sistemler kullanılır. Ayrıca ELISA HIV, RSV, influenza virüs ve HSV

Ig. M Yakalama (Capture) Yöntemi • Özellikle etkene özgül Ig. M antikorlarının araştırılmasında yalancı pozitiflikleri (romatoid faktöre bağlı) ve yalancı negatiflikleri (fazla miktarda özgül Ig. G varlığına bağlı) ortadan kaldırmak amacıyla kullanılır. • Anti-insan Ig. M antikorları bağlanmış çukurlara hasta serumu eklenir. Hasta serumunda var olan bütün Ig. M’ler etkene özgül olsun • Sonra özgül antijen eklenir. • Antijen daha önce yakalanmış kendisine özgül Ig. M’lere bağlanır. • Antijene özgül enzimle işaretli konjugat ve daha sonra kromojenik substrat eklenir. • Reaksiyon sonucu oluşan renk değişikliği spektrofotometrik olarak değerlendirilir.

Elisa çeşitleri https: //www. researchgate. net/figure/Sch ematic-presentation-of-basic-types-of. ELISA-enzyme-linked-immunosorbentassay-a_fig 1_334656471

İmmünofloresans Yöntemi (IFA) • Lamda yapılan katı faz yöntemidir. • Konjugatın işaretlendiği madde bir flokrom boyasıdır ve değerlendirme floresans mikroskobu ile yapılır. • En sık kullanılan boya fluorescein isothiocyanate (FITC)’tır.

Direk floresans antikor testi (DFA) • Bu yöntem klinik örnekte antijen aramak için kullanılır. • Antijen aranan klinik örnek lamın üstüne tespit edilir. • Üzerine floresanla işaretlenmiş özgül antikor eklenir ve örnek bir süre bekledikten sonra yıkanır. • Antijenle birleşen floresanlı antikor yıkama işlemiyle uzaklaşmaz ve floresan mikroskobunda gri- https: //slideplayer. biz. tr/slide/10695624/

İndirekt floresans antikor testi (IFA) • Bu yöntemde klinik örnekteki antikor araştırılır. • Lamın üzerine araştırılacak özgül antikora ait antijen fikse edilir. • Hasta serumu lamların üzerindeki özel alanlara damlatılır. • Bir süre bekledikten sonra yıkanır. • Antijen-antikor birleşmesi olmuşsa antikor yıkama işlemiyle uzaklaşmaz. • İkinci aşamada örneğe floresanla işaretli AHG eklenir. • İşaretli AHG ilk aşamada oluşan antijen-antikor kompleksine bağlanır ve floresan mikroskobunda gri-yeşil floresan izlenir. • Sonuçlar 1 -2 saat içinde alınabilir. https: //slideplayer. biz. tr/slide/10695624/

Western Blot • Bu yöntemde mikroorganizmaya ait tüm doğal antijenler (protein, glikoprotein) poliakrilamid jel elektroforezi ile nitroselüloz kağıt membranlarda molekül ağırlıklarına göre bantlar halinde ayrıştırılır. • Bu membranlar şeritler halinde hazırlanır ve hasta serumu dilüsyonları ile muamele edilip inkübe edilir. • Hasta serumunda bu antijenlere karşı özgül antikorun varlığı enzimle işaretli anti-insan antikorlarının ve daha sonra da substratın eklenmesiyle saptanır. https: //precisionbiosystems. com/westernblot-troubleshooting-guide/

https: //www. moleculardevices. com/technology/western-blot#gref https: //www. sinobiological. com/category/wb-protein-transfer

Western Blot Nerelerde kullanılır? • HIV tanısının doğrulanması (kesinleştirilmesi) • T. pallidum • B. burgdorferi (Lyme hastalığı) Western Blot ile benzer mekanizmaya sahip diğer yöntemler: • İmmünoblot assay • Line immünoassay (LIA), • Rekombinant immünoblot assay (RIBA)

Viral Nükleik Asitlerin Saptanması • Tanısal virolojide kalitatif ve kantitatif sonuçlar alınmasında en hızlı gelişen alan moleküler yöntemleridir. Nükleik asitlerin saptanmasına yönelik temel teknikler: o Hibridizasyon o DNA Amplifikasyon: PCR. o DNA dizilimi (Sequencing) mikroarray.

Nükleik Asid Hibridizasyon n İki nükleotid diziliminin baz birleşme kuralları ilkesine göre biraraya gelmesi esasına dayanır n Sarmal yapıdaki nükleik asidler birbirinden ısı ile ayrıştırılabilir (denaturation) http: //walpaperdesign. blogspot. com/2011/02/nuclei c-acid-hybridization. html

Blot hibridizasyon Blot teknikleri hedef moleküle göre adlandırılırlar Southern blot: DNA prob Northern blot: RNA prob İnsitu hibridizasyon: DNA, RNA https: //www. slideshare. net/shobejee/molecularhybridization-of-nucleic-acids

In situ hibridizasyon n Hedef dokuda ¨ ¨ n Prob ¨ ¨ n DNA RNA Prob isaretleme direkt ¨ Radioaktif mat. ¨ Fluorescein Indirekt ¨ Digoxin ¨ Antidigoxin ab http: //www. abnova. com/support/resources. asp? switchfunctionid={B 4 285500 -DB 85 -435 D-BE 02 -2 BF 420 D 5 C 70 D}

Mikroarra y Bir çok gen bölgesinin araştırılmasını sağlar https: //www. genome. gov/about-genomics/fact-sheets/DNAMicroarray-Technology

• DNA Amplifikasyonu: Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Çok genis bir kullanım alanı olan ve bir DNA diziliminden milyarlarca DNA kopyası olusturabilen, temel olarak nükleik asid hibridizasyonuna dayalı bir yöntemdir. • PCR’da çoğaltılması istenen özgül DNA segmenti hedef alınır. Bu amaçla yaklaşık 20 bazlık özgül nükleotid dizileri (primerler) kullanılır. • PCR’da primerlerin viral DNA’ya tutunup karşıt sarmalı sentezleyebilmesi için serbest nükleotidlere ve reaksiyonu katalizleyecek ısıya dirençli taq polimeraz enzimine gereksinim vardır. https: //www. elveflow. com/microfluidic-reviews/general-microfluidics/microfluidic-pcr-qpcr-rtpcr/

RT-PCR • RNA genomlu virüslerde PCR işleminden önce revers transkripsiyon ile komplementer DNA(c. DNA)’nın elde edilmesi gerekir. Bu tür PCR’a RT-PCR denmektedir. • HIV, HCV enfeksiyonu gibi durumlarda hastaların tedaviye yanıtını izlemek için virüs yükünün bilinmesi önemlidir. Birim hacimdeki virüsün kopya sayısını kantite edebilen bu yöntemler içinde real-time PCR yaygın bir kullanım alanı bulmuştur. • Duyarlılığı artırmak için bazen nested PCR da uygulanabilir. Bu yöntemde PCR işlemi iki kez https: //www. sigmaaldrich. com/content/dam/sigma-aldrich/life-science/molecular biology/pcr/how_reverse_transcriptase%20(RT)%20 PCR%20 works_big. png