Veselbas zintu maistra studiju programma uzturzintn Studiju kurss

Veselības zinātņu maģistra studiju programma uzturzinātnē Studiju kurss: Jaunā un ģenētiski modificētā pārtika ĢENĒTISKI MODIFICĒTĀ PĀRTIKA INDRIĶIS MUIŽNIEKS, Rīga, 2016. gada jūnijs

ĢM AUGU UN PĀRTIKAS IDENTIFICĒŠANAS METODES Tēmu apgūstot paredzēts: apzināt ĢM augu un pārtikas identificēšanas metožu galvenās grupas: morfoloģisko / fenotipisko identificēšanu; bioķīmisko identificēšanu; imunoloģisko identificēšanu; molekulārbioloģiskai identificēšanu; detalizēti apskatīt praksē izmantojamo galveno identificēšanas metožu principus un realizācijas nosacījumus: kapilārās plūsmas metodei, ELISA metodei, PCR un konkurējošās PCR metodei, RT (laikā novērojamās PCR) metodei; apgūt ĢM pārtikas marķēšanas principu pielietojuma nosacījumus; iepazīties ar pārtikas produktu paraugu ņemšanas noteikumiem ĢM piesārņojuma analīzei; gūt priekšstatu par analīžu izmaksām, apjomiem, Latvijā izdarītajām kontrolēm

Uzdevumi analītiskajam darbam Esošie tiesību akti izvirza kontrolējošajām institūcijām sarežģītus uzdevumus. ĢMO testēšana • kvalitatīvi (jā / nē) • kvantitatīvi (atbilstība 0, 9 % pieļaujamajai koncentrācijai, kura nav jāmarķē) Nepieciešamas: • validētas metodes • kontroles paraugi (salīdzināmais materiāls) • īpaši testi ES teritorijā atļautu un neatļautu ĢMO atšķiršanai

ĢMO KONTROLES METODES Kontrolējamās īpašības Morfoloģijas un raksturojums: augšanas īpatnību izskats; rezistence pret antibiotikām; rezistence pret specifiskiem vides faktoriem un kaitēkļiem.

Kultūras īpatnības TOLERANCE PRET HERBICĪDIEM

ĢMO KONTROLES METODES Kontrolējamās īpašības Proteīni: fermentu raksturojums / zimogrammas; imunoloģiskās metodes, piem. , antivielas pret Bt toksīnu, EPSP sintetāzi vai pat proteīnu

ĢMO KONTROLES METODES Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) E - sārmainā fosfatāze; S - p-nitrofenilfosfāts

Puskvantitatīva raundapa rezistento sojas miltu analīze See Lipp et al. , J. AOAC Int. , in print

Laterālās kapilārās plūsmas metode (imunoloģiskie indikatorpapīri)

ĢMO KONTROLES METODES Kontrolējamās īpašības Nukleīnskābes : PCR un PCR modifikācijas, piem. , 35 S PROMOTERA SPECIFISKIE PRAIMERI: 5’-CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG-3’ 5’-TCCTCTCCAAATGAACTTCC-3’ AMPLIFICĒ 180 BP SECĪBU Varbūtība 20 b. p. secības nejaušai klātbūtnei genomā – mazāka par 1 no 1012

PCR izmantošana ĢMO atrašanai Metodes princips 1. Parauga homogenizēšana 2. DNS ekstrakcija 3. Ekstraģētās DNS kontrole 4. DNS fragmenta amplifikācja 5. Elektroforēze

POLIMERĀZES ĶĒDES REAKCIJA (PCR) DNS paraugu denaturē – 94 o. C, 5 min, DNS pavedieni atdalās viens no otra Praimeri piesaistās DNS komplementārai secībai (hibridizācija), 45 – 65 o. C, 30 s DNS paraugu denaturē 94 o. C, 30 s Temperatūras izturīga DNS polimerāze sintezē jaunus DNS pavedienus 72 o. C, 30 s Taq (Thermus aquaticus) DNS polimerāze

POLIMERĀZES ĶĒDES REAKCIJA (PCR)

DNS ekstrakcija nepieciešamie materiāli un reaktīvi 1. Homogenizēts analizējamais materiāls 2. Ekstrakcijas buferis 3. Denaturējošs savienojums 4. Proteīnus noārdošs ferments

DNS attīrīšana 1. Centrifugēšana 2. Supernantanta sorbcija uz nesēja 3. Minikolonnas uzpildīšana 4. Kolonnas mazgāšana un žāvēšana 5. DNS eluēšana

DNS attīrīšana Jonu apmaiņas hromatogrāfija DNS attīrīšana no ĢMO paraugiem, izmantojot iepriekšsagatavotas kolonnas

POLIMERĀZES ĶĒDES REAKCIJA (PCR) REAKCIJAS GAITA Etaps Parameteri DNS denaturēšana 5 min 95 o. C Amplificēšana (30 s 54 o. C; 60 s 72 o. C; 30 s 95 o. C)x. N Ciklu skaits (N) 40 Beigu cikls 3 min 72 o. C Atdzesēšana 1 min 4 o. C Silšanas ātrums 1, 5 o/s Atdzesēšanas ātrums 1, 5 o/s

POLIMERĀZES ĶĒDES REAKCIJA (PCR) Kopējais laika sadalījums ĢMO analīzei Parauga sagatavošana 2 + 3 h Iegūtās DNS kontrole 1 h Amplificēšana (PCR) 3 h Fragmentu elektroforēze 1 h Kopējais laiks 10 h Nepieciešamā materiāla daudzums > 100 mg

POLIMERĀZES ĶĒDES REAKCIJA (PCR) Optimāli notiekošā PCR reakcijā DNS tiek amplificēta: Cikls Kopiju skaits Masa (g) 1. 25. 30. 35. 40. 10 8, 5 x 107 2, 7 x 109 8, 6 x 1010 2, 8 x 1012 2, 0 x 10 -18 1, 6 x 10 -11 5, 2 x 10 -10 1, 7 x 10 -8 5, 4 x 10 -7

POLIMERĀZES ĶĒDES REAKCIJA (PCR)

ĢMO atrašana Sample Apm. 20 ng DNS, krāsota ar etīdijbromīdu DNA Extraction % GMO content M nt 0 0. 10. 5 2 100 C+ base pairs (bp) 500 400 300 200 100 Results Amplification 180 bp Electrophoresis

NOS 3’ terminator plant DNA A NOS-3 180 bp CP 4 EPSPS petunia EPSPS CTP GM 09 447 bp B plant DNA double 35 S-2 195 bp NOS-1 Skrīnings E 35 S promotera un nos terminatora atrašana KVALITATĪVAS PCR palīdzību Roundup Ready® sojas pupās 35 S-1 GM 05 GM 08 169 bp GM 07 % GMO content (modified from Meyer & Jaccaud, 1997) M nt 0. 0 0. 1 0. 5 2 100 C+ base pairs (bp) % GMO content M nt 0. 0 0. 1 0. 5 2 100 C+ base pairs (bp) 500 400 300 200 195 bp 100 180 bp C+ = plasmid p. BI 121 100 29

PCR konkurējošas DNS klātbūtnē

ĢMO KONTROLES METODES REAL TIME (laikā novērojamā kvantitatīvā) PCR Rosche Light Cycler ABI Prism 7500

REAL TIME (laikā novērojamā) PCR: FLUORESCENCES REZONANSES ENERĢIJAS PĀRNESE (FRET) Meklējamajai DNS specifiskā secība Apgrieztie DNS secības atkārtojumi – FRET indikācija

REAL TIME (laikā novērojamā) PCR Fluorescējošās krāsvielas Ierosina zilā gaisma – spīd zaļš

REAL TIME (laikā novērojamā) PCR Fluorescējošās krāsvielas Ierosina zaļā gaisma – spīd sarkans

FLUORISCĒJOŠĀS ZONDES IZMANTOŠANA RT-PCR Denaturēšana Hibridizācija R = Uztvērējs Q = Dzēsējs • Polimerizācija R Praimers 1 forward primer 5’ 3’ 5’ Q Q Zonde 5’ 3’ 5’ Praimers 2 Praimeri nodrošina DNS amplifikāciju, zonde – amplificētā fragmenta uzskaiti

RT -PCR principi 96 identisku reakciju atkārtojumi dod būtiski atšķirīgus rezultātus reakcijas beigu posmā

SLIEKŠŅA CIKLS (CT) Sliekšņa ciklā iespējams uztvert fluorescences signāla pacelšanos virs fona līmeņa Labi korelē ar sākotnējo amplificējamās sekvences kopiju skaitu u Ja sekvence ir divas reizes vairāk, uztvērēja fluorescence parādās vienu ciklu ātrāk u Ja sekvence ir divas reizes mazāk, uztvērēja fluorescence parādās vienu ciklu vēlāk

REAL TIME PCR: DNS secību kvantitatīva noteikšana Sliekšņa līmeņa noteikšana dod lineārus mērījumu rezultātus plašā diapazonā

GMO KVANTITATĪVĀS NOTEIKŠANAS METOŽU SALĪDZINĀJUMS Farrid E. Ahmed, detection of genetically modified organisms in foods, Ti. Btech, 20 (5), 215 – 223, 2002

GMO KVANTITATĪVĀS NOTEIKŠANAS METOŽU SALĪDZINĀJUMS

ĢMO kontrole. PVD ĢMO kontroles programmu rezultāti 2014. gadā plānoti 50 ĢMO paraugi – desas, šokolāde, konfektes, rīsu produkti, augu olbaltums. Ernests Zavadskis Pārtikas un veterinārā dienesta Pārtikas uzraudzības departamenta direktors 41

ĢMO kontrole. Situācija Eiropā. (Dati no Ātrās brīdināšanas sistēmas) Neatļautas ĢMO modifikācijas

LABĀ LABORATORIJAS PRAKSE Good Laboratory Practice (GLP) tiek lietota, lai līdz minimumam samazinātu kļudu iespējas, kas varētu iespaidot testēšanas rezultātus vai jebkuru citu pētniecības darbību. Piemērojama: · Gatavojot datus ĢMO pieteikumam, atbilstoši ES Direktīvai 18/2002; · Veicot pārbaudes vai uzraudzības analīzes atbilstoši ES Regulai 1829/2003

Prasības laboratorijām Dalībvalstu laboratorijām, kuras veic analīzes saskaņā ar šo ieteikumu, ir jābūt akreditētām saskaņā ar EN ISO/IEC 17025/1999 vai sertificētām saskaņā ar atbilstošu shēmu, un tām ir regulāri jāpiedalās kvalifikācijas testēšanas shēmās, ko organizē vai koordinē nacionāli vai starptautiski atzītas laboratorijas un/vai valsts, starptautiskās organizācijas. Pārtikas produktus, ko iesniedz analīzei saskaņā ar šo ieteikumu, nodod laboratorijām, kas atbilst Direktīvas 93/99/EEK 3. panta nosacījumiem.

Prasības laboratoriju darba kvalitātei un laboratoriju inspicēšanai Noteikumi nr. 398, 03. 09. 2002 2. Noteikumi attiecas uz pētījumiem, pārbaudēm (izņemot klīniskās) un testiem (turpmāk – pētījumi), kurus veic, lai iegūtu ziņas par biocīdu, ķīmisko vielu un ķīmisko produktu īpašībām, kā arī par to bioloģiskas izcelsmes preparātu vai dzīvu organismu īpašībām, kurus paredzēts izmantot zāļu, augu aizsardzības līdzekļu, kosmētisko produktu, veterināro zāļu, pārtikas piedevu un dzīvnieku barības piedevu sastāvā (turpmāk – pārbaudāmā viela vai organisms), un to bīstamību cilvēku veselībai un videi. Pētījumu rezultāti paredzēti iesniegšanai Labklājības ministrijā, Veselības ministrijā, Vides ministrijā un Zemkopības ministrijā, kā arī šo ministriju padotības iestādēs (turpmāk – kompetentās institūcijas).

Paraugs: (Pārbaudāmie objekti; kontrolējamie produkti; nesēji) Uzglabāšana, marķēšana un apstrāde, kas izslēdz kontaminācijas, fizikālās, ķīmiskas vai bioloģiskas bojāšanās varbūtību.

Personāls: (Administratīvie un zinātniskie pētnieki, kvalitātes vadības nodaļa) vadītāji, Jābūt atbilstošai izglītībai un konkrētajai apmācībai, lai nodrošinātu paredzēto uzdevumu izpildi; Jābūt sertificētam, kārtībai. atbilstoši EC 450013

Telpas: (Nodalītas telpas kontroles un pārbaudāmo paraugu saņemšanai un pirmapstrādei; Laboratorijas; telpas paraugu un datu uzglabāšanai) Pietiekama savstarpējās izolācijas pakāpe, kas varētu novērst jebkuras funkcijas vai darbības nevēlamo iespaidu uz veicamajiem pētījumiem.

Darbības: (Paraugu pieņemšana, marķēšana, uzglabāšana utt. ; laboratorijas analīzes; datu apstrāde un uzglabāšana) Apstiprināti rakstiski standartizēti protokoli katram darbības un analīžu veidam; Darba operāciju validēšana; Rakstiski protokoli par testu izpildi un rezultātiem; Apstiprinātas formas ziņojums par analīzes rezultātiem.

Iekārtas un materiāli: (Izveidoti un izvēlēti atbilstoši veicamajam testam) Standartreaktīvi un šķīdumi; Apkope, kalibrēšana, apzīmēšana un marķēšana.

ĢMO parauga ņemšanas metodes KOMISIJAS IETEIKUMS (Vadlīnijas) (2004. gada 4. oktobris) paraugu ņemšanas un noteikšanas tehnisko vadlīniju izstrādi ģenētiski modificētiem organismiem un materiāliem, kas iegūti no ģenētiski modificētiem organismiem vai atrodas produktos Regulas (EK) Nr. 1830/2003 nozīmē Oficiālās kontroles veic bez iepriekšēja brīdinājuma, izņemot gadījumus, kur ir vajadzīgs iepriekšējs paziņojums tirgus dalībniekam. Oficiālās kontroles veic produktu, kuri satur vai var saturēt ĢMO, vai no ĢMO ražotas pārtikas un lopbarības jebkurā ražošanas, pārstrādes, glabāšanas un izplatīšanas posmā, ieskaitot importēšanas vietu.

2004. g. vadlīnijas : - balstās uz pieņēmumu, ka krava ir neviendabīga; - prasa par kārtu palielināt analītiskā darba apjomu; - prasa pielietot statistisku modelēšanu (“predictive statistical models”); - nosaka riska līmeņus piegādātājam un patērētājam.

Viendabīga krava Neviendabīga krava Pieņēmums, ka katra krava var būt nehomogēna.

ĢMO parauga ņemšanas metodes • Pārtikas un lopbarības produktu partija: produkta daudzums, kas nosūtīts vai saņemts vienā laikā, un ietilpst atsevišķā līgumā vai transportēšanas dokumentā. • Pieauguma paraugs: mazs vienāds produkta daudzums, kas paņemts no katras atsevišķas paraugu ņemšanas vietas partijā visā partijas dziļumā (statiskā paraugu ņemšana) vai ņemts no produkta plūsmas noteiktā laika posmā (birstošu produktu paraugu ņemšana). • Kopējais paraugs: produkta daudzums, kas iegūts, apvienojot un samaisot vairākus pieauguma paraugus, kas ņemti no konkrētas partijas. • Laboratorijas paraugs: produkta daudzums, kas ņemts no kopējā parauga, kurš domāts laboratorijas pārbaudei un testēšanai. • Analītiskais paraugs: homogenizēts laboratorijas paraugs, kas sastāv vai nu no visa laboratorijas parauga vai tā raksturīgas daļas. • Kontrolparaugs: paraugs, kas glabāts konkrētu laika periodu ieviešanas vai tiesāšanās mērķiem.

ĢMO parauga ņemšanas metodes Paraugu ņemšanas protokola pamatā ir divpakāpju procedūra, kas ļauj, ja nepieciešams, iegūt ĢMO klātbūtnes līmeņu novērtējumu kopā ar to saistīto nenoteiktību, kas izteikta kā Standarta novirze (SD), neizvirzot pieņēmumu par iespējamo ĢMO neviendabīgumu. Lai ļautu novērtēt SD, pirmkārt, ir jāizveido kopējais paraugs un jāatvasina analītisks paraugs, kurā analizē ģenētiski modificētu materiālu klātbūtni. Ja iegūtais analītiskais rezultāts ir tuvu noteiktajai robežvērtībai (± 50 % no tās vērtības), iesaka analizēt atsevišķus lietas pieauguma paraugus, lai nodrošinātu saistītās nenoteiktības mērījumu.

Laboratorijas parauga homogenizācija, ekstrakcija. . . Testa paraugs Analītiskais paraugs - testa parauga daļa, kas nonāk mēraparatūrā un tiek analizēts testa reakcijā Analītiskajam paraugam jābūt pietiekami lielam, lai reprezentētu testa paraugu. Kvalitatīvai noteikšanai ar PCR tam jāsatur vismaz 20 modificētās DNS kopijas, bet kvantitatīvai - vismaz 100

Vadlīnijas iesaka: - piauguma paraugus ņemt pa 0. 5 kg, lai to kopapjoms atbilstu ne mazāk kā 0. 01% no kravas, bet lielu kravu gadījumā to kopskaits nepārsniegtu 100; - no tiem izvēlas 20 paraugus, kuros kvantitatīvi nosaka modificētos piemaisījumus.

ĢMO parauga ņemšanas metodes Partijās no 50 līdz 500 tonnām kopējā parauga lielums ir 0, 01 % no kopējā partijas lieluma. Partijām, kas mazākas par 50 tonnām, kopējā parauga lielums ir 5 kg. Partijām, kas lielākas par 500 tonnām, kopējā parauga lielums ir 50 kg.

ĢMO parauga ņemšanas metodes Vajadzētu sākt ar skrīninga metodi, lai pārbaudītu ĢMO klātbūtni. Ja ir iegūts pozitīvs rezultāts, veic specifiskās metodes ģenētiskās konstrukcijas un/vai transformācijas gadījumam. Ja tirgū atrodas dažādi ĢMO ar tādu pašu ģenētisko konstrukciju, īpaši iesaka gadījuma specifisko metodi. Kvantitatīvās analīzes rezultātus izsaka kā ĢM DNS kopiju skaita procentuālo daudzumu saistībā ar mērķa taksona specifisko DNS kopiju skaitu, kas aprēķināts haploīdu genomu izteiksmē.

ĢMO parauga ņemšanas metodes Pašreizējās zinātniskā pieredze neļauj atklāt un noteikt daudzumu visiem ĢMO vai no ĢMO ražotiem pārtikas un lopbarības produktiem, kuri ir atzīti laišanai tirgū, izmantojot vienu konkrētu metodi. Vienādi uzticamus rezultātus var nodrošināt vairākas testēšanas pieejas.

ENGL – izcilības tīkls 1999. gadā EK kopējo pētījumu centrs (the Joint Research Centre of the Commission, JRC), koordinēt ES valstu ĢMO testēšanas laboratoriju, lai izstrādātu validētas metodes, sagatavotu kontroles paraugus un lietotu salīdzināmus materiālus un metodes. • Eiropas ĢMO laboratoriju tīkls, ENGL • 45 kontroles laboratorijas kas spēj testēt sēklas, graudus, pārtiku, lopbarību, vides paraugus • Darbojas kā kopējs Eiropas ekselences centrs

ĢM PĀRTIKA IR MŪSU IKDIENA