Veselbas zintu maistra studiju programma uzturzintn Studiju kurss
Veselības zinātņu maģistra studiju programma uzturzinātnē Studiju kurss: Jaunā un ģenētiski modificētā pārtika ĢENĒTISKI MODIFICĒTĀ PĀRTIKA INDRIĶIS MUIŽNIEKS, Rīga, 2016. gada jūnijs
ĢENĒTISKI MODIFICĒTI AUGI PĀRTIKĀ Tēmu apgūstot paredzēts: apgūt zināšanas par galvenajiem ģenētiskajiem elementiem, kurus izmanto ĢM augu ieguvē: klonējamajiem gēniem, to kodētajām pazīmēm un izcelsmi, izmantojamiem regulācijas elementiem un to darbības īpatnībām, plašāk lietotajām vektorsistēmām, augu šūnu transformācijas metodēm, augu organismu reģenerācijas metodēm; • gūt izpratni par ĢM augu daudzveidību; • saņem informāciju par galvenajām ĢM augu grupām un izplatītākajām īpašībām, par bioķīmiskajiem mehānismiem, kuri nodrošina modifikāciju; • novērtēt ĢM augu izplatības dinamiku pasaules lauksaimniecībā pēdējo 10 gadu laikā; • novērtēt ĢM augu izmantošanas un sastopamības iespējas dažādos pārtikas produktos.
ĢENĒTISKĀS MODIFIKĀCIJAS MOLEKULĀRIE PAMATI GĒNS - NUKLEOTĪDU SECĪBA, KAS KODĒ PROTEĪNA STRUKTŪRU O P KODĒJOŠĀ DAĻA T GĒNA DARBĪBU REGULĒ: P - promoters, nukleīnskābes rajons, kurā sākas gēna informācijas pārrakstīšana par m. RNS O - operators, nukleīnskābes rajons, kas regulē promotera aktivitāti T - terminators, nukleīnskābes rajons, kurā tiek pārtraukta gēna transkripcija
Augu šūnas īpatnības: šūnas siena; organellas; vakuolas; transporta signālsecības
Hloroplastu genoma izmēri - ~ 70 - ~ 220 k. b. p. , vidēji 160 k. b. p. Annals of Botany 103: 625– 633, 2009
Augu mitohondriju genoma raksturojums (dzīvnieku – 15 – 18 k. b. p. , sēņu – 18 – 78 k. b. p. ) http: //www. ndsu. edu/pubweb/~mcclean/plsc 731/genome 8. htm Gēnu plūsma no mitohondrijiem un hloroplastiem uz kodolu
ĢM AUGA IEGŪŠANA Regulatori Visā auga organismā aktīvie regulatori: Promoteri: Ca. MV 35 S RNA; nopalīna, oktopīna, manopīna sintāžu (nos, ocs, mas ), ubikvitīna, aktīna. NOS-terminators,
Regulatori Ca. MV: Cauliflower mosaic virus (puķkāpostu mozaīkas vīruss) Ca. MV: 50 nm diametra kapsīds, ~ 8030 b. p. ds DNS ar vienpavediena pārrāvumiem, NS ~16% viriona masas. Inficē Cruciferae, Resedaceae, Solanaceae augu dzimtas, pārnesēji - laputis
Regulatori Ca. MV replikācija notiek līdzīgi cilvēka B tipa hepatīta vīrusam: uz DNS matricas tiek sintezēta par genomu garāka 35 S RNS, kuru vīrusa revertāze atkal pārvērš DNS formā.
http: //www. patentlens. net/daisy/promoters/ext/navaggregator/navaggr. Promotera patenti pieder Monsanto un Rokfellera universitātei
Regulatori Ubikvitīns – visās eikariotu šūnās sastopams neliels (76 aminosk. atlikumi, 8564 Da) proteīns, ar kuru iezīmē proteosomās noārdīšanai paredzētos proteīnus http: //www. patentlens. net/daisy/promoters/ext/navaggregator/navaggr. Patenti: Mycogen, Monsanto
Regulatori Aktīns – visās eikariotu šūnās sastopams citoskeleta komponents, kas piedalās šūnas formas veidošanā, kustību un dalīšanās procesos
Regulatori Alkoholdehidrogenāzes promotera inducējama sistēma. Citas inducējamas sistēmas – tet, glikokortikoīdu hormoni, metālu joni, vides stress, gaisma Alcohol dehydrogenase I (Adh-I) encoded by the alc A gene; transcriptional activator protein Alc. R; ethanol, ethyl methyl ketone or other alcohols/ketones act as inducers of the gene expression. Patents - Syngenta
Sēklu specifiski promoteri Plant Biotechnology Journal (2010) 8, pp. 588– 606 http: //biopharminternational. findpharma. com/biopharm/article. Detai Regulatori
Regulatori Agrobacterium inducētie sakņu audzēji nos - nopalīna sintēzes gēna terminators no Agrobacterium Ti plazmīda Nopalīns Agrobacterium Ti plazmīdas helios. bto. ed. ac. uk/bto/microbes/crown. htm
Regulatori Nuclear Matrix Attachment Region (MAR) un augu gēnu ekspresija. MAR – kodolu strukturējošas proteīna fibrillas, ar kurām mijiedarbojas specifiskas DNS secības, piem. , 1, 2 kbp. RB 7 MAR no tabakas sakņu specifiskā gēna 3’-flankējošā rajona. MAR klātbūtnē ievērojami (~30 x) pieaug ekspresija no stipriem augu promoteriem (Ca. MV 35 S RNS, NOS, OCS), vājos promoterus ietekmē maz. Gēnu klusināšanas parādību (silencing) novēršana.
Nesēji - vektorplazmīdas Selekcionējamie marķiergēni - rezistences -kanamicīna vai G 148 : neomicīna fosfotransferāze (npt II), -higromicīns B : higromicīna fosfotransferāze (hyg B), - gentamicīns : gentamicīna acetiltransferāze, - streptomicīns : streptomicīna fosfotransferāze, - fosfinotricīns (basta, bioalofoss, glufosināts): fosfinotricīna acetiltransferāze (pat).
ĢM AUGA IEGŪŠANA Nesēji - vektorplazmīdas Selekcionējamie marķiergēni – krāsa un gaisma Reportiergēni dod iespēju tieši novērot gēnu ekspresijas vietu un laiku : GUS (b-glukuronidāze), GFP (zaļi fluoriscējošais proteīns), LUX (luciferāze).
Nesēji - vektorplazmīdas Marķiergēna darbība audu specifiska promotera kontrolē a-amilāzes promoters darbojas endospermā. ĢM rīsā tas kontrolē baktēriju izcelsmes reportiergēnu gus A. Zilā krāsa rodas, šķeļot sintētisku gus A substrātu, kurā iemērc dīgstošus rīsa graudus.
Nesēji - vektorplazmīdas Pēc transgēna iegūšanas slekcijas marķierus vairs nevajag. Selekcijas marķiera klātbūtne apgrūtina tālāko rīcību ar transgēnu. Selekcijas marķieris (piem. , antibiotiku rezistence) apgrūtina transgēna izmantošanu. Transgēni augi bez selekcijas marķieriem. Transformācija bez marķiera vai MAT vektori (multi-auto-transformation).
ĢM AUGA IEGŪŠANA AUGU TRANSFORMĀCIJA Augu audu un veselu augu apstrāde makroinjekcija; mērcēšana; apstrāde ar baktērijām vakumā. Protoplastu apstrāde PEG klātbūtnē; ar mākslīgajām liposomām; elektroporācija; sapludināšana. Augu šūnu un šūnu kultūru apstrāde mikroinjekcija; balistiskā (biolistics) transformācija; agrobaktēriju metodes.
ĢM AUGA IEGŪŠANA Augu transformācijas metodes
ĢM AUGA IEGŪŠANA Augu transformācijas metodes Apstrādājot ar celulāzēm un pektināzēm, iegūst augu protoplastus
ĢM AUGA IEGŪŠANA Augu transformācijas metodes Balistiskā transformācija
ĢM AUGA IEGŪŠANA Augu transformācijas metodes Balistiskā transformācija
ĢM AUGA IEGŪŠANA Augu transformācijas metodes Agrobaktēriju sistēma Arī dabā agrobaktērijas inficē augus un integrē to hromosomās savu genomu, veidojot t. s. “rētu audzējus” un “bārkšsaknes”.
ĢM AUGA IEGŪŠANA Augu transformācijas metodes Agrobaktēriju sistēma
Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes ĢM AUGA IEGŪŠANA Transformācijas procesu regulē apm. 100 baktēriju gēni: baktērijas piesasitīšanās pie auga šūnām (adhēzija); plazmīdas pārnese; plazmīdas nokļūšana šūnas kodolā (nuclear targeting); integrācijas mērķa secību izvēle genomā. Insercijas notiek transkripcionāli aktīvā hromatīnā.
ĢM AUGA IEGŪŠANA Augu transformācijas metodes Agrobaktēriju sistēma
ĢM AUGA IEGŪŠANA Augu transformācijas metodes no Escherichia coli Agrobacterium divplazmīdu sistēma. Virulences plazmīda un klonējamo gēnu kasete
ĢM AUGA IEGŪŠANA Augu transformācijas metodes
ĢM AUGA IEGŪŠANA Auga organisma reģenerācija Diferencētas augu šūnas saglabā totipotenci – spēju de- un rediferencēties, reģenerēt veselu auga organismu
ĢM AUGA IEGŪŠANA Auga organisma reģenerācija
ĢM AUGA IEGŪŠANA Auga organisma reģenerācija
Auga organisma reģenerācija Fitohormoni: inolil-3 -etiķskābe (auksīns) citokinīni giberelīni etilēns abscisskābe
Auga organisma reģenerācija Auksīnu iedarbība (apikālās dominances likvidēšana): sānsakņu un piesakņu veidošanās; augļu veidošanās; fototropisms; lapu un ziedu krišana; DNS sintēze.
Auga organisma reģenerācija Fitohormoni Auksīni Indoliletiķskābe, IAA; Indolilsviestskābe, IBA; Naftilēnetiķskābe, NAA; 2, 4 dihlorfenoksietiķskābe, 2, 4 -D
Auga organisma reģenerācija Citokinīnu iedarbība: šūnu dalīšanās (citokinēze); orgānu attīstība – asnu veidošanās; novecošanas kavēšana, hloroplastu veidošanās; sānu pumpuru veidošanās; āuksīnu inducētās stiepšanās inhibīcija.
Auga organisma reģenerācija Fitohormoni Kinetīni
Auga organisma reģenerācija Giberelīnu iedarbība (līdzība ar augu patogēnās sēnes Giberella fujikuroi = Fusarium moniliforme iedarbību): sēklu dīgšana; stiepšnās garumā.
Auga organisma reģenerācija Fitohormoni Giberilīni
Auga organisma reģenerācija Fitohormoni
ĢM AUGA IEGŪŠANA AUGU KONSTRUĒŠANA
ĢM AUGA IEGŪŠANA AUGU KONSTRUĒŠANA
ĢM augu šķirņu attīstība ĢM augu paauudzes: modeļorganismi labākas audzēšanas tehnoloģijas, herbicīdu, kukaiņu izturība vakcīnas un terapeitiskie proteīni palielināta pārtikas vērtība izturība pret sēņu un baktēriju slimībām izturība pret sausumu un sāls stresu 1982 – pirmais ĢM augs – Km-rezistenta tabaka 1985 – pirmie lauka izmēģinājumi ar ĢM augiem 1990 – pirmā vakcīna no augiem: Spa. A proteīns tabakas lapās 1992 – sēņu un baktēriju infekciju rezistence augiem 1994 – pirmais ĢM augs tirgū – FS tomāti 1996 – Bt-kokvilna, kukurūza; herbicīdu rezistenta soja, kokvilna, kukurūza un rapsis 1997 – PHB kukurūza (neizdodas attīrīt) 1999 – zelta rīss
ĢM augu šķirņu izveides process Tehnoloģijas izveide Pētījumi Sanie. Gēna dzamie Gēnu atrašana un funkcijas Tehnoloģijas Ražošanas mērķi raksturošana apstiprināšana izveide eksperimenti uzsākšana In planta 1 -? gadi 1 -2 gadi 1 -3 gadi Laišana tirgū Ražošanas izvēršana 1 -2 gadi 1 gads 6 - 11 gadi Kritēriji darba rezultātiem katrā posmā • Bioloģiskā un biotehnoloģiskā efektivitāte • Atbilstība likumiskās regulācijas prasībām • Vides, veselības un drošības apsvērumi • Administratīvais un sociālais atbalsts • Sekmīga darbība mēroga palielināšanā (rajonēšana) • Oficiālās izplatīšanas atļaujas saņemšana • Panākumi komercializācijā
AUGU IZMANTOŠANA BIOTEHNOLOĢIJĀ: PRIEKŠROCĪBAS 1. Šķirņu (ģenētisku marķieru) daudzveidība 2. Liels pēcnācēju skaits 3. Reģenerācijas spējas, fitohormonu vienkāršība 4. Šūnu kultūru īpatnības 5. Ētiski motīvi
AUGU IZMANTOŠANA BIOTEHNOLOĢIJĀ: TRŪKUMI 1. Šķirņu un kultivāru ģenētiskais neviendabīgums, poliploīdija (kartupeļu paveidu hromosomu n 24… 144) 2. Somatoklonālā variēšana 3. Sarežģījumi ar viendīgļlapjiem 4. Organellu genomu daudzveidība un izmēri 5. Ētiski motīvi
ĢM augu daudzveidība
ĢM PĀRTIKAS VEIDI ĢM AUGI VAI TO PRODUKTUS SATUROŠA PĀRTIKA: Nozīmīgākie procesi: augkopība, pārtikas pārstrāde. Izmantojamie organismi un produkti: visbiežāk soja, kukurūza un rapsis; arī kartupeļi, rīss, saulespuķes un tomāti; iestrādes par gandrīz visām kultūraugu grupām. Mērķi: jaunas augu īpašības, ražošanas efektivitāte, uzlabota pārtikas kvalitāte, funkcionāla (terapeitiska) pārtika.
ĢM PĀRTIKAS VEIDI Pārtika ar uzlabotu uzturvērtību: • tomāti ar paaugstinātu vitamīnu saturu; • zemesrieksti ar samazinātu alergēnu daudzumu; • kartupeļi ar uzlabotu cietes sastāvu; • kvieši ar palielinātu folskābes daudzumu; • rīsi ar palielinātu A vitamīna provitamīna saturu; • sojas eļļa ar augstu oleīnskābes saturu; • rapšu eļļa ar augstu laurīnskābes sāļu saturu.
Global Review of Commercialized Transgenic Crops. Clive James, Jan. 2013, ISAAA 2015. gadā – 180 milj. hektāru
ĢM augu audzētājas valstis, 2015 Salīdzinot ar 2013. gadu, audzētāju skaitam pievienojušās Kuba un Sudāna, audzēšanu pārtraukušas Vācija, Polija un Zviedrija
Galvenās ĢM augu grupas, 2015
ĢMO, kas atļauti lietošanai ES valstīs pārtikā un dzīvnieku barībā
Antisens – tehnoloģija gēnu apklusināšanai 2010. -2012. g. g. ES bija atļauts izmantot un audzēt kartupeļus ar uzlabotu cietes sastāvs – apgriezts ar granulām saistītā cites sintāzes ( gbss) gēns
HERBICĪDU TOLERANCE - IZPLATĪTĀKAIS MODIFIKĀCIJAS VEIDS
HERBICĪDU TOLERANCE - IZPLATĪTĀKAIS MODIFIKĀCIJAS VEIDS REZISTENCE PRET RAUNDAPU - MODIFICĒTS EPSP SINTETĀZE
HERBICĪDU TOLERANCE - IZPLATĪTĀKAIS MODIFIKĀCIJAS VEIDS Fosfinotricīns (glufosināts) Glutamīnskābe Fosfinotricīns ir vairāku herbicīdu sastāvā, tas kavē glutamīna sintēzi no glutamīnskābes. Fosfinotricīnu inaktivē no baktērijām iegūstams enzīms pat
HERBICĪDU TOLERANCE - IZPLATĪTĀKAIS MODIFIKĀCIJAS VEIDS
TRANSGĒNU BIOTEHNOLOĢIJA JAUNAS, TEHNOLOĢISKI NODERĪGAS ĪPAŠĪBAS AUGIEM, PIEM. , REZISTENCE PRET KUKAIŅIEM Bacillus thuringiensis toksīna kristāls
Bt toksīnu tipi
ĢM AUGI LAUKSAIMNIECĪBĀ Bt TOKSĪNA TOKSISKUMS ŽURKĀM Agrochemical and Environmental News, April 2001, Washington State University, USA
Sagatavošanā Pārbaudes lauksaimniecībā • Kukurūza, kas rezistenta pret Āzijas graudu dūrēju • Rīss, kas rezistents pret baktēriju izraisītu puvi
Sagatavošanā Siltumnīcā • papaja ar aizkavētu nogatavošanos • vīrusu rezistenta papaja Laboratorijā mango ar aizkavētu nogatavošanos tungro vīrusa rezistents rīss ar vitamīnu A bagātināts rīss pret cerošanās slimību rezistenti banāni
Zelta rīss Rīsā pārnesti divi gēni no narcisēm un viens no baktērijām. Šo gēnu komplekss sintezē b-karotīnu no geranil-geranil difosfāta, savienojuma, kas rīsos parasti tālāk netiek izmantots.
Pret rizomānijas vīrusu rezistentas cukurbietes Auga genomā klonēts rizomānijas vīrusa kapsīda proteīns, kura ekspresija aptur vīrusa replikāciju
Jaunās pieejas augu genoma modifikācijai Virus-induced gene silencing A. Purkayastha, I. Dasgupta / Plant Physiology and Biochemistry 47 (2009) 968 967– 976
Jaunās pieejas augu genoma modifikācijai Virus-induced gene silencing A. Purkayastha, I. Dasgupta / Plant Physiology and Biochemistry 47 (2009) 968 967– 976
Jaunās pieejas augu genoma modifikācijai Zn-pirkstu nukleāzes Genes VII, Lewin B. , 2005, p. 276/382
Jaunās pieejas augu genoma modifikācijai Zn-pirkstu nukleāzes Modificēta Fok. I endonukleāze Zinc-finger nucleases as gene therapy agents, D Carroll, 2008
Jaunās pieejas augu genoma modifikācijai TALE faktori Transcription activator like effectors (TALEs) (Boch et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009). TALEs are produced by plant pathogens in the genus Xanthomonas, which deliver the proteins to plant cells during infection Proteīna-DNS mijiedarbības specifiskums TALE efektorā Christian M. et al. , Targeting DNA Double-Strand Breaks with TAL Effector Nucleases, Genetics 186: 757– 761 (October 2010)
Jaunās pieejas augu genoma modifikācijai CRISP-Cas CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) Cas (CRISPR-associated) genes, CRISPR-based adaptive immune systems Terns and Terns, 2011
Jaunās pieejas genoma modifikācijai CRISP-Cas Mali P. et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas 9. Science, V 339, p. 824, 2013
- Slides: 74