Verdere optimalisatie van het Fordproject voor het gebruik
Verdere optimalisatie van het Ford-project voor het gebruik van Next-generation sequencing in de moleculaire diagnostiek. Bachelorproef - Liselotte Vergote Centrum Medische Genetica Gent Stagementor: Mevrouw Kathleen Claes Promotor: Mevrouw Griet Vanbillemont
Inhoudsopgave Ford-project CFTR, HFE en MTHFR Validatie van Ford-assays Next-generation Sequencing Resultaten CFTR, HFE en MTHFR SNP’s in Ford-primers Besluit
Ford-project Geautomatiseerde workflow Standaard procedure Reductie van de prijs Uitvoerbaar door iedereen
Ford-project Werkwijze ‘voor’ Ford Werkwijze met Ford Buffer, d. NTP’s, Mg. Cl 2, Taqpolymerase, DNA en primers primermix Kapa Robust mastermix, DNA en primers primermix Verschillende PCR-programma’s 1 PCR programma Voor mutatiescreening van elk gen is een apart protocol en specifieke detectiemethoden De mutaties in genen kunnen via de Ford-workflow geanalyseerd worden
CFTR, HFE en MTHFR Nog niet geïntegreerd in de Ford-workflow Ford-assays moeten ontwikkeld en gevalideerd worden
CFTR, HFE en MTHFR Opgespoorde mutaties in het HFE-gen (hemochromatose): c. 845 G>A (assay 1) c. 187 C>G (assay 2) c. 193 A>T (assay 2) Opgespoorde mutaties in het MTHFR-gen (trombofilie): c. 677 C>T (assay 1) Opgespoorde mutaties in het CFTR-gen (mucoviscidose): Top 50 mutatielijst (21 assays)
Ford-project MTHFR assay 1: c. 677 C>T in exon 4 AAGAACTCAGCACTCCACCCAGAGCCCCCAGCCTGTGCGAGG ACGGTGAGAGTGGGGTGGAGCTTATGGGCTCTCCTGGGCCC CTCACCTGGATGGGAAAGATCCCGGGGACGATGGGGCAAGTGATGCCCAT GTCGGTGCATGCCTTCACAAAGCGGAAGAATGTGTCAGCCTCAAAGAAAAG CTGCGTGATGATGAAATCGRCTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAAGTGCTTC AGGTCAGCCTCAAAGCTCCCTGCTTCGGGGTGGCCTTTGGGGTAACCTGCC AATAGGGATGACAGTCAGGAGAGG
CFTR, HFE en MTHFR 32 DNA controlestalen voor CFTR, 10 DNA controlestalen voor HFE en MTHFR PCR uitvoeren volgens de Ford-condities en laten sequeneren via Next-generation sequencing met Mi. Seq
Next-generation Sequencing Library Preparation Cluster generation Sequencing by synthesis
Next-generation Sequencing
Next-generation Sequencing
Next-generation Sequencing
Next-generation Sequencing
Next-generation Sequencing
Next-generation Sequencing
Next-generation Sequencing
Next-generation Sequencing
Resultaten CFTR, HFE en MTHFR Gevonden mutaties via screening in de gewone diagnostiek vergelijken met mutaties gevonden met Mi. Seq Komen mutaties gevonden in diagnostiek en met Mi. Seq overeen? CFTR HFE MTHFR ü ü ü
Ford-project
SNP’s in Ford-primers Theoretisch geen SNP’s in de laatste 5 nucleotiden AAGAACTCAGC Afspraak in het CMGG: geen SNP’s in de laatste 12 nucleotiden AAGAACTCAGC Primer bevat SNP risico op allele drop-out Primers met gedegenereerde base
SNP’s in Ford-primers Ford-condities nog altijd allele drop-out Annealingstemperatuur: 60°C optimale temperatuur bepaald per Ford-assay Annealingstijd: 10 seconden 35 seconden
BRCA 1 ---17 en BRCA 1 ---35 SNP c. 3119 G>A in reverse primer
BRCA 1 ---17 en BRCA 1 ---35 Mutatie c. 3481_3491 del homozygoot zichtbaar
BRCA 1 ---17 en BRCA 1 ---35 Bij optimale annealingstemperatuur 54, 3°C
BRCA 1 ---17 en BRCA 1 ---35 Resultaten bij 54°C
BRCA 1 ---17 en BRCA 1 ---35 Bij verlengde annealingstijd (35 seconden)
Resultaten aangepaste condities Gewone Ford-assay met gedegenereerde base SERPINF 1 ---5 SERPINF 1 ---9 Optimale temperatuur (55, 3°C en 59, 2°C) Heterozygoot Verlengde annealingstijd Licht heterozygoot Heterozygoot BRCA 1 ---17 BRCA 1 ---35 Optimale temperatuur (54, 3°C) Heterozygoot Verlengde annealingstijd Licht heterozygoot BRCA 1 ---20 BRCA 1 ---52 Optimale temperatuur (57, 4°C) Licht heterozygoot Heterozygoot Verlengde annealingstijd Homozygoot Heterozygoot
Besluit Validatie CFTR, HFE en MTHFR voor Ford-workflow Verkregen mutaties CFTR, HFE en MTHFR komen overeen Installeren softwarefilters + cut-off waarde bepalen
Besluit SNP’s in primers Verlagen annealingstemperatuur positieve invloed, niet toepasbaar in Fordworkflow Verlengen annealingstijd + gedegenereerde base minder risico op allele drop-out aanpassen in Ford-workflow
Verdere optimalisatie van het Ford-project voor het gebruik van Next-generation sequencing in de moleculaire diagnostiek. Bachelorproef - Liselotte Vergote
- Slides: 30