Vectores virales para usos de Terapia Gnica Manel

Vectores virales para usos de Terapia Génica Manel Cascalló, Ph. D. Grup de Terapia Gènica Laboratorio de Investigación Translacional Hospital Duran i Reynals

Terapia génica: definición Reintrodución de material genético capaz de curar o atenuar la progresión de una enfermedad.

Terapia génica: definición DNA GEN normal RNA Proteína normal

Terapia génica: definición Ausencia de proteína DNA GEN RNA alterado Proteína anormal alterado RNA Proteína normal

Terapia génica: definición Ausencia de proteína DNA GENES: GEN RNA alterado Proteína anormal alterado Causantes de enfermedades Posibles dianas terapéuticas RNA Proteína normal

Terapia génica: definición Reintrodución de material genético capaz de curar o atenuar la progresión de una enfermedad. mayor especificidad de acción

Terapia génica: definición Reintrodución de material genético capaz de curar o atenuar la progresión de una enfermedad. mayor especificidad de acción mayor potencial terapéutico, al inducir cambios fundamentales en los parámetros fenotípicos de la enfermedad

Terapia génica: avances tecnológicos Aislamiento e identificación de genes terapéuticos Desarrollo de vectores de transferencia

Terapia génica: barreras extracelulares BARRERAS DE TEJIDO * Membranas conectivas * Epitelio vascular * Membrana hemato-encefálica * Mielina PROTEÍNAS INACTIVADORAS * Proteínas séricas de carga positiva * Proteasas/nucleasas BARRERAS INMUNOLÓGICAS * Respuesta inmune cellular * Anticuerpos * Complemento

Terapia génica: barreras intracelulares Vector-transgen Interacción Liberación DNA/ Transporte al núcleo Proteína transferida Localización transgen Direccionalidad de la transcripción

Características del vector ideal • expresión prolongada del transgén • inmunológicamente inerte • expresión regulable • selectividad hacia el tipo celular deseado • capacidad del transgén a incorporar • fácil producción y a títulos elevados • integración • baja transmisibilidad a células germinales

Vectores usados en terapia génica 1. - no virales • DNA “desnudo” • liposomas catiónicos • condensados de DNA • electroporación • pistolas de DNA sistemas “físicos”

Vectores usados en terapia génica 1. - no virales • DNA “desnudo” • liposomas catiónicos • condensados de DNA • electroporación • pistolas de DNA 2. - virales clasificables en base a: • capacidad integrativa • capacidad replicativa

Vectores usados en terapia génica 1. - no virales • DNA “desnudo” • liposomas catiónicos • condensados de DNA • electroporación • pistolas de DNA 2. - virales clasificables en base a: • capacidad integrativa Integrativos: • retrovirus • lentivirus • virus adenoasociados no integrativos • capacidad replicativa • adenovirus • Herpes simplex virus

Vectores usados en terapia génica 1. - no virales • DNA “desnudo” • liposomas catiónicos • condensados de DNA • electroporación • pistolas de DNA 2. - virales clasificables en base a: • capacidad integrativa vectores replicativos • capacidad replicativa vectores no replicativos

Terapia génica: vectores usados en protocolos clínicos Número de protocolos Fuente: “The Journal of Gene Medicine” © John Wiley & Sons, 2001 212 164 37 13 5 77 55 5 5 22 35, 8 % 27, 7 % 6, 2 % 2, 2 % 0, 5 % 13, 0 % 9, 3 % 0, 8 % 3, 7 %

Terapia génica: vectores usados en protocolos clínicos Número de protocolos 72, 4 % Fuente: “The Journal of Gene Medicine” © John Wiley & Sons, 2001 212 164 37 13 5 77 55 5 5 22 35, 8 % 27, 7 % 6, 2 % 2, 2 % 0, 5 % 13, 0 % 9, 3 % 0, 8 % 3, 7 %

Del virus al vector vírico: ciclo viral 1. - INFECCIÓN 2. - REPLICACIÓN

Del virus al vector vírico: ciclo viral 1. - INFECCIÓN 2. - REPLICACIÓN

Del virus al vector vírico: ciclo viral 1. - INFECCIÓN 2. - REPLICACIÓN introducción del genoma viral

Del virus al vector vírico: ciclo viral 1. - INFECCIÓN introducción del genoma viral expresión de proteínas tempranas reguladoras 2. - REPLICACIÓN

Del virus al vector vírico: ciclo viral 1. - INFECCIÓN introducción del genoma viral expresión de proteínas tempranas reguladoras 2. - REPLICACIÓN

Del virus al vector vírico: ciclo viral 1. - INFECCIÓN introducción del genoma viral expresión de proteínas tempranas reguladoras 2. - REPLICACIÓN expresión de proteínas estructurales

Del virus al vector vírico: ciclo viral 1. - INFECCIÓN introducción del genoma viral expresión de proteínas tempranas reguladoras 2. - REPLICACIÓN expresión de proteínas estructurales + replicación del DNA

Del virus al vector vírico: ciclo viral 1. - INFECCIÓN introducción del genoma viral expresión de proteínas tempranas reguladoras 2. - REPLICACIÓN expresión de proteínas estructurales + replicación del DNA producción de nuevos virus

Del virus al vector vírico: construcción de vectores 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 mu y genoma viral gen temprano casete de expresión promotor gen interés (transgén) poly-A 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 mu y vector

Del virus al vector vírico: construcción de vectores introducción del genoma viral: TRANSDUCCIÓN expresión de proteínas tempranas reguladoras casete de expresión promotor replicación del DNA gen interés (transgén) poly-A 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 mu y vector secuencias adyacentes (en “cis”) producción de nuevos virus

Del virus al vector vírico: construcción de vectores introducción del genoma viral: TRANSDUCCIÓN expresión de proteínas tempranas reguladoras casete de expresión promotor replicación del DNA gen interés (transgén) poly-A 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 mu y vector secuencias adyacentes (en “cis”) expresión del transgén producción de nuevos virus

Del virus al vector vírico: construcción de vectores célula “empaquetadora” (packaging) célula normal DNA del vector Genoma celular expresión del transgén proteínas virales Genoma celular o plásmido genes virales (complementación en “trans”) producción de nuevos virus

Problemática de la construcción de vectores • probabilidad de recombinación entre genomas para generación de partículas competentes para replicación (RCV) • complejidad del genoma viral: desbalance de la producción en “cis” y en “trans” • retención de proteínas virales en los vectores que actúan como inmunógenas • toxicidad de las proteínas virales en las células empaquetadoras • difícil escalado de los procesos

Vectores retrovirales (Rv) envuelta lipídica glicoproteína de membrana LTR U 3 R U 5 cápside genoma RNA gag pro pol att U 3 R U 5 PBS y / y’ proteasa integrasa transcriptasa reversa env PPT att (progenoma: 7 a 11 K casete de expresión promotor gen interés (transgén) poly-A LTR U 3 R U 5 att PBS y / y’ U 3 R U 5 PPT att

Vectores retrovirales (Rv): propiedades Capacidad máxima del inserto: 8 kb Integración al azar en el genoma huésped (progenoma) Necesidad de división celular para una transducción efectiva (excepción: familia de los lentivirus) Poco inmunogénicos Mucha experiencia clínica Ejemplos: Familia oncotrópicos: M-MLV Familia lentivirus: HIV-1, SIV

Vectores adenovirales (Ad) fibra pentón / hexón MLP/TL L 2 L 3 L 1 E 1 L 4 L 5 E 3 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 mu ITRy ITR E 2 B genoma DNA (ds) E 2 A E 4 (genoma: 36 Kb casete de expresión promotor gen interés (transgén) poly-A 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 mu ITRy ITR

Vectores adenovirales (Ad): propiedades Capacidad máxima del inserto: 8 kb No integración: se mantiene de forma episómica Se pueden obtener con altos títulos (>1. 1013 vp/ml) Muy inmunogénicos Tropismo para células de origen epitelial, a las que infectan con alta eficiencia Altamente bio-seguros Ejemplos: Ad-2 Ad-5

Vectores derivados de Herpes simplex (HSV) Elementos repetidos invertidos flanqueantes cápside proteína del tegumen b a a c a b envuelta lipídica Ul : “unique long” glicoproteína vectores tipo “amplicones” origen de replicación de HSV gen interés (transgén) poly-A Us : “unique short” (genoma: 152 Kb) genoma DNA (ss) promotor c a vectores derivados del genoma entero locus de las proteínas “immediate early” y a b promotor ba a c gen interés (transgén) poly-A ca

Vectores derivados de Herpes simplex (HSV): propiedades Capacidad máxima del inserto: hasta 30 kb Se mantienen en forma de ciclo lisogénico (infección latente) Dan lugar a una expresión del transgén prolongada Tropismo para células neuronales Poca experiencia clínica Ejemplos: HSV-1 HSV-2

Vectores derivados de virus adenoasociados (AAV) TR (145 bp) TR Rep Cap (genoma: 5, 1 Kb) TR (145 bp) casete de expresión TR promotor transgén poly-A

Vectores derivados de virus adenoasociados (AAV): propiedades Capacidad máxima del inserto: 4, 5 kb Integrativos al azar Dan lugar a una expresión del transgén prolongada (hasta 2 años) Forman concatenámeros, lo que permite augmentar el tamaño del inserto que pueden contener Poca respuesta inmunológica Bio-seguros Ejemplos: AAV-2 AAV-5

Comparación entre vectores virales PROBLEMA ALTERNATIVA Requerimiento de división Mutagénesis insertacional Obtención de títulos bajos Vectores lentivirales lentivirus Bio-seguridad Vectores híbridos con no-humanos adenovirus Alta inmunogenicidad Vectores “gutless” Direccionamiento del vector (“targeting”) Herpes simplex Toxicidad de la proteínas en “trans” en cél. empaquetadoras Nuevas delecciones Adeno-asociados Poco tamaño del inserto Producción difícil Uso de los concatenámeros retrovirus Uso de proteínas de envoltorio de otros virus

Vectores virales: nuevas estrategias (1) Vectores híbridos Vectores “mezcla” que intentan combinar propiedades de más de un vector Ejemplos: - pseudo-tipado (substitución de una partícula de la cápside viral por otra de un virus distinto) Ej. vectores retrovirales con la prot G del VSV - combinación de vectores adenovirales y AAV, para obtener la capacidad integrativa - encapsulación de genomas retrovirales en un virus adenoviral

Vectores virales: nuevas estrategias (2) Vectores replicativos condicionales (CRV) Vectores mutantes que actúan como virus salvajes en células con determinadas características genéticas, llevando a su muerte. Utilidad en la terapia génica del cáncer Célula normal: replicación abortiva replicación productiva: lisis celular Virus mata a la célula tumoral, y se expande a las células vecinas Virus oncolítico Célula tumoral Ejemplos: Adenovirus (CRA) : ONYX-015, Ad. D 24 Herpes virus : G 207