Utilisation de la CGH en cytogntique hmatooncologie Le

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Utilisation de la CGH en cytogénétique hémato-oncologie: Le cas de Mr Ras… Génétique –hématologie

Utilisation de la CGH en cytogénétique hémato-oncologie: Le cas de Mr Ras… Génétique –hématologie oncologique CHU St Eloi Montpellier

Histoire de la maladie 1/02/16 17/02/16 • Homme • 20 ans • Pas d’ATCD

Histoire de la maladie 1/02/16 17/02/16 • Homme • 20 ans • Pas d’ATCD particulier • Asthénie • Douleur gingivale bilatérale • Bilan dentaire normal • Antalgique (paracétamol codéiné) + Anti-inflammatoire (AINS) • Hyperleucocytose (69, 7 G/L) dont 97% blastes • Légère anémie (12, 5 g/d. L) • Thrombopénie (116 G/L) Urgences CH Mendes ……Hématologie Montpellier … Suspicion LAM (1/03/16)

LAM : généralités Hémopathies malignes caractérisées par l’expansion clonale de cellules myéloïdes immatures dans

LAM : généralités Hémopathies malignes caractérisées par l’expansion clonale de cellules myéloïdes immatures dans la moelle, le sang ou autres tissus Incidence annuelle: 4 pour 100 000 adultes Taux de mortalité : 4 à 6/100 000 par an Fréquence augmente après 40 ans Age moyen : 65 ans Peu fréquente chez les enfants Atteinte des deux sexes de manière sensiblement égale

Bilan clinique à l’arrivée

Bilan clinique à l’arrivée

Bilan biologique sanguin à l’arrivée (1) En faveur d’une leucémie aigue myéloblastique

Bilan biologique sanguin à l’arrivée (1) En faveur d’une leucémie aigue myéloblastique

Le diagnostic de LAM nécessite Une étude morphologique : cytologie et cytochimie Un immunophénotypage

Le diagnostic de LAM nécessite Une étude morphologique : cytologie et cytochimie Un immunophénotypage Analyse cytogénétique : caryotype + FISH Biologie moléculaire: recherche de remaniements géniques Ponction de moelle en sternal

Myélogramme Etablir le diagnostic Frottis médullaire MGG (x 10) Moelle : 92% blastes Frottis

Myélogramme Etablir le diagnostic Frottis médullaire MGG (x 10) Moelle : 92% blastes Frottis médullaire MGG (x 20)

Myélogramme (2) Frottis médullaire MGG (x 100) GE GE

Myélogramme (2) Frottis médullaire MGG (x 100) GE GE

Cytochimie Moelle MGG (X 100) Noir soudan : 25% (MO) Bleu de toluidine :

Cytochimie Moelle MGG (X 100) Noir soudan : 25% (MO) Bleu de toluidine : 4% (MO) Leucémie aigue myéloblastique sans maturation granuleuse ou LAM 1 (FAB)

Immunophénotypage Outil majeur Diagnostic des leucémies aigues Complète l’analyse morphologique Technologie simple et rapide

Immunophénotypage Outil majeur Diagnostic des leucémies aigues Complète l’analyse morphologique Technologie simple et rapide

Immunophénotypage (2) Granularité (SSC) Analyse les cellules en suspension devant un faisceau lumineux Mesure

Immunophénotypage (2) Granularité (SSC) Analyse les cellules en suspension devant un faisceau lumineux Mesure les caractéristiques physiques des cellules : T/S/F Etude bi-paramétrique taille/structure Suspension cellulaire cellules sanguines Granuleux Monocytes Lymphocytes (B, T, NK) Débris cellulaires Erythrocytes Taille (FSC)

Immunophénotypage (3) Granularité (SSC) Isolement et Identification des cellules blastiques: BLASTES : SSClow/CD 45

Immunophénotypage (3) Granularité (SSC) Isolement et Identification des cellules blastiques: BLASTES : SSClow/CD 45 low 97% de cellules dans la région blastique (Sang veineux) CD 45 faible Degré de différentiation cellulaire CD 34+ HLA-DR+ Expression partielle et hétérogène Leucémie aigue

Immunophénotypage (4) Détermination de la lignée Lignée B: CD 19 - Lignée T :

Immunophénotypage (4) Détermination de la lignée Lignée B: CD 19 - Lignée T : CD 3 - Lignée myéloïde MPO 23% (cytochimie +) Marqueurs myéloïdes « généraux » CD 13 - CD 117 - CD 33 61% Marqueurs granulocytaires et monocytaires CD 15 - CD 65 - CD 14 - CD 64 - CD 11 c- Marqueurs érythrocythaires et plaquettaires Glyco. A- CD 41 Marqueurs aberrants Lignée B : CD 79 a- CD 10 - CD 22 Lignée T : CD 3 - CD 1 a- CD 2 - CD 4 - CD 5 - CD 7 98% CD 8 - CD 56 - CD 57 - Marqueurs spécifiques des Lpd. C (Leucémies dérivées de cellules dendritiques plasmocytoïdes) CD 4+/CD 56+ négatif

Bilan Leucémie aigue myéloïde Absence d’expression de marqueurs caractéristiques des autres lignées : -

Bilan Leucémie aigue myéloïde Absence d’expression de marqueurs caractéristiques des autres lignées : - Lignée B - Lignée T (exception : CD 7) 30% LAM témoin d’immaturité Conclusion : 97% de blastes sanguins CD 34+, HLA-DR+, avec expression des marqueurs myéloïdes MPO (expression faible), CD 33 et expression de CD 7. Profil phénotypique identique dans la moelle osseuse. Classification OMS : LAM sans maturation CD 7: suivi maladie résiduelle

Etude cytogénétique (1 ) Moëlle Numération : 227 M Culture synchronisées : 24 h

Etude cytogénétique (1 ) Moëlle Numération : 227 M Culture synchronisées : 24 h et 48 H Bandes GHG Frottis médullaires (FISH)

Inclusion dans le protocole BIG-1 : essai Backbone Inter-Group-1 Nombre de patients : 3000

Inclusion dans le protocole BIG-1 : essai Backbone Inter-Group-1 Nombre de patients : 3000 Essai de phase 3 visant à améliorer la survie globale des LAM de l’adulte de 18 à 60 ans en comparant INDUCTION Idarubucine (FD) Vs Daunorobicine CONSOLIDATION Cytarabine (FD) Vs Cytarabine (DI) ENTRETIEN Rémission complète GREFFE Mycophénolate Mofétil Vs Prophylaxie standard

Etude cytogénétique (2) Etape 1: diagnostic d’exclusion (48 H) Réarrangements CBF de bon pronostic

Etude cytogénétique (2) Etape 1: diagnostic d’exclusion (48 H) Réarrangements CBF de bon pronostic FISH sur frottis LSI RUNX 1 Spectrum Green Probe (Vysis) Pas de t(8; 21) RUNX 1 T 1/RUNX 1 LSI RUNX 1 T 1 Spectrum Orange Probe (Vysis) LSI CBFB Dual Color Break Apart Rearrangement probe (Vysis) Pas de réarrangement CBFB (inv 16)

Etude cytogénétique Etape 2: Recherche de réarrangement MLL et EVI FISH sur frottis pronostic

Etude cytogénétique Etape 2: Recherche de réarrangement MLL et EVI FISH sur frottis pronostic péjoratif dans LAM LSI MLL Dual Color Break Appat Rearrangement Probe (Vysis) Pas de réarrangement MLL EVI 1 t(3; 3), inv(3) Break probe (Kreatch) Pas de réarrangement EVI 1

Etape n° 3 : réalisation du caryotype (bandes GHG) 46, XY, der (7) t

Etape n° 3 : réalisation du caryotype (bandes GHG) 46, XY, der (7) t (7; ? )(p 15; ? ), t(10; 11)(p 13; q 21)[11]

46, XY, der (7) t (7; ? )(p 15; ? ), t(10; 11)(p 13;

46, XY, der (7) t (7; ? )(p 15; ? ), t(10; 11)(p 13; q 21), del (20)(q 11, 2) q[6]

Confirmation par FISH 20 q Deletion Breakapart (Cytocell) Présence d’une délétion 20 q dans

Confirmation par FISH 20 q Deletion Breakapart (Cytocell) Présence d’une délétion 20 q dans 17% des cellules

Biologie moléculaire Mutation du gène ECBPA (19 q 13. 1) 10% LAM de l’adulte

Biologie moléculaire Mutation du gène ECBPA (19 q 13. 1) 10% LAM de l’adulte Pronostic favorable Mutation du gène NPM 1 (5 q 35) 30% des LAM de l’adulte CD 34 faible Mutation en tandem du gène FLT 3 : FLT 3 -ITD (13 q 12) 20 à 30% LAM de l’adultes Pronostic péjoratif Triple négatif

Suivi ? Adulte jeune CEBPA - /NPM 1 - FLT 3 -ITD Triple négatif

Suivi ? Adulte jeune CEBPA - /NPM 1 - FLT 3 -ITD Triple négatif T(10; 11) Add 7 p? ? +/- de 20 q sans marqueurs pour le suivi t(8; 21) neg; Inv(16) neg MLL neg; EVI 1 neg Diagnostic LAM 1 Hypercytaire CMF Confirmation

Analyse de la moelle par CGH array Extraction ADN et digestion Dépôts ADN témoin

Analyse de la moelle par CGH array Extraction ADN et digestion Dépôts ADN témoin (CY 3) ADN tumoral (CY 5) Mélange équimolaire Sondes Hybridation Défaut d’ADN tumoral (Délétion) Lavage + scan Equilibre Excès d’ADN Tumoral (Amplification) Mesure de la fluorescence + Analyse d’images

Analyse de la moelle par CGH array Puce utilisée: AGILENT Cancer CGH+SNP 4*180 K

Analyse de la moelle par CGH array Puce utilisée: AGILENT Cancer CGH+SNP 4*180 K Logiciel: cytogenomics

Chromosome 5 : 6 Microdélétions 5 q Deletion (Cytocell) è Délétion 5 q 95%

Chromosome 5 : 6 Microdélétions 5 q Deletion (Cytocell) è Délétion 5 q 95% è par microréarrangements Chromothripsis Del 5 q 5

Vérification si t(5; 7) Add (7)p 5 7 WCP : Pas de t(5; 7)

Vérification si t(5; 7) Add (7)p 5 7 WCP : Pas de t(5; 7) CGH : Add 7 p ? 5

Chr 10 Chr 11

Chr 10 Chr 11

Résultat en faveur d’une t(10; 11) Points de cassure dans les gènes MLLT 10

Résultat en faveur d’une t(10; 11) Points de cassure dans les gènes MLLT 10 (10 p 12) et PICALM (11 q 14) è Translocation rare observée dans les LAL-T, LAM à marqueurs T. .

Conclusion LAM 1 hypercytaire CD 7 marqueur aberrant (lignée T) Caryotype complexe avec plus

Conclusion LAM 1 hypercytaire CD 7 marqueur aberrant (lignée T) Caryotype complexe avec plus de 3 anomalies : 46, XY, der (7) t (7; ? )(p 15; ? ), t(10; 11)(p 13; q 21)[11] 46, XY, der (7) t (7; ? )(p 15; ? ), t(10; 11)(p 13; q 21), del (20)(q 11, 2) q[6] Chromothripsis (instabilité génomique +++) CGH: délétion 5 q confirmation del 20 q Anomalie du 7 en cours d’exploration

Conclusion (2) Suivi possible en FISH frottis grâce à la sonde délétion 5 q

Conclusion (2) Suivi possible en FISH frottis grâce à la sonde délétion 5 q J-1 : congélation de sperme J 27: 2 CGR + 8 CPA INDUCTION Sang 76% DG J-2 • Idarabine • Aracytidine • TT confort J 15 PREGREFFE Sang 17% Mo 75% Del 5 q 78% J 27 • Echec induction • Rattrapage GREFFE Pré-greffe Del 5 q 45% J 56 • J 27 • J 100 Del 5 q neg

Remerciements CACHEUX Valère, GAZAGNE Isabelle, MACE Alexandra, PLATERO Dolorès LODE Laurence, ANGLES Mathieu, COURNUT

Remerciements CACHEUX Valère, GAZAGNE Isabelle, MACE Alexandra, PLATERO Dolorès LODE Laurence, ANGLES Mathieu, COURNUT Elisabeth, GUITTARD Caroline HICHERI Yostr, BRET Caroline, RUSSELLO Jennifer Hématologie, Génétique, Hématologie oncologique CHU St Eloi, Montpellier