UNIVERZITET U BEOGRADU MEDICINSKI FAKULTET Dr Vladimir Vukov

UNIVERZITET U BEOGRADU MEDICINSKI FAKULTET Dr Vladimir Vukov Korelacija odnosa neutrofil/limfocit i ishoda nakon hemioterapije kod metastatskog kolorektalnog karcinoma -rad iz uže specijalizacije- Mentor: prof. dr Svetislav Jelić

Odnos neutrofil limfocit – biomarker kancerske inflamacije • Inflamacija je ključna komponenta tumorskog mikrookruženja • Razvoj i rast tumora nastaje kao rezultat interreakcije između tumora i stromalnog tkiva zajedno sa krvnim sudovima i imunološko/inflamatornim ćelijama domaćina. • U sistemske promene koje se detektuju kod pacijenata sa malignim solidnim tumorima spadaju leukocitoza i neutrofilija • Ova hematološka stanja su u signifikantnoj korelaciji sa stadijumom bolesti i posledično, lošom prognozom

Odnos neutrofil limfocit – biomarker kancerske inflamacije • Kancerom uzrokovana mijeloproliferacija utiče na imuni odgovor organizma, što ima integralan uticaj na tumorogenezu i metastaziranje • Kvalitativne promene mijelopoeze posredovane neoplastičnim procesom, dovode do nakupljanja nezrelih mijeloidnih ćeliija koje deluju imunosupresivno • Pokazano je kod pacijenata sa metastatskim kolorektalnim karcinomom da je odnos neutrofil/limfocit nezavisan faktor preživljavanja • Chua i sar. promovišu odnos neutrofil/limfocit kao potencijalni korisni biomarker sistemskog inflamatornog odgovora u predikciji kliničkog ishoda pacijenata sa metastatskim KRK-om tretiranih prvom linijom hemioterapije • Kada se hemioterapijom normalizuje visok neutrofil/limfocit odnos, produžava se preživljavanje

CILJEVI RADA • Prikazati apsolutni broj leukocita, kao i relativni broj neutrofila i limfocita pre/posle sistemske hemioterapije (s. HT) metastatskog kolorektalnog karcinoma (m. KRK-a) • Prikazati uticaj s. HT na neutrofil/limfocit odnos (NLR) • Pokazati da li postoji razlika u apsolutnom broju leukocita, potom u relativnom broju neutrofila i limfocita, kao i NLR pre/posle s. HT m. KRK-a među ispitanicima koji su nakon hirurškog lečenja tretirani adjuvantnom hemioterapijom (a. HT) i onima koji nisu • Pokazati da li postoji odnos između promene NLR pre/posle s. HT i ishoda bolesti

MATERIJALI I METODE • • Prospektivna studija sprovedena je na Službi medikalne onkologije KBC Zemun tokom 2011 -2013. godine Studijom su obuhvaćena 46 ispitanika prosečne životne dobi 63± 11 (3482) godina, ženskog pola n=25 (54. 3%) i muškog pola n=21 (45. 7% Osnovni inkluzioni kriterijum za studiju bilo je postojanje metastatske bolesti karcinoma kolona (m. KRK) i mogućnost sprovođenja sistemske hemioterapije (s. HT) Ispitanici su podeljeni u dve grupe, a kriterijum je bilo sprovođenje adjuvantne hemioterapije (a. HT) nakon hirurškog lečenja Prvoj grupi ispitanika (n=19) primenjena je a. HT nakon operativnog lečenja lokalnog i lokalno uznapredovalog KRK. Tokom vremena se kod ovih ispitanika razvila metastatska bolest, te su tretirani s. HT Druga grupa (n=27) obuhvatila je ispitanike koji su zbog već postojeće metastatske bolesti odmah tretirani s. HT nakon operativnog lečenja Ispitanici su, nakon informisanja o studiji, dobrovoljno pristali na učešće

MATERIJALI I METODE • Kod svih studijskih ispitanika, metastatska bolest (stadijum IV/DUKES D) je dijagnostikovana bilo u momentu prezentacije, bilo tokom praćenja (uključujući i tokom primene a. HT) • Primenjivane su sledeće kombinacije hemioterapijskih agenasa po protokolima za m. KRK: FU/FA, FOLFOX, kao i 5 fluorouracil/folna kiselina/irinotekan (FOLFIRI) • Ispitanici su tretirani sa 2 (2, 2%), 3(2, 2%), 4(13, 0%), 5 (2, 2%), tj. 6 (37%) ciklusa • Hemioterapijska kombinacija za metastatsku bolest određivana je u zavisnosti da li se radilo o inicijalnoj hemioterapiji metastatske bolesti ili o prvoj sistemskoj hemioterapiji nakon a. HT

MATERIJALI I METODE • Procena efekata primenjene s. HT m. KRK-a vršena je kontrolnim pregledima zahvaćenog/ih organa dostupnim radiološkim metodama (CT pregledi grudnog koša, abdomena i karlice, RTG srca i pluća, EHO abdomena) • Ishod nakon poslednjeg ciklusa s. HT m. KRK-a prema RECIST kriterijumima definisan je kao progresija bolesti (engl. Progression of disease - PD), stabilna bolest (engl. Stable disease -SD), kao i parcijalna remisija (engl. Partial remission - PR)

MATERIJALI I METODE • Kod svih ispitanika je određivan apsolutni broj leukocita, apsolutni broj neutrofila i limfocita, kao i odnos broja neutrofila i limfocita (NLR) pre započinjanja s. HT i tokom procene terapijskog efekta nakon sprovedenog poslednjeg ciklusa s. HT • Hematološke analize citoloških parametara su rađene na aparatu COULTER® Hm. X Hematology Analyzer, proizvođača „Beckman Coulter“, Službe laboratorije KBC Zemun • Potom je vrednost odnosa broja neutrofil/limfocit (NLR) dobijena računskim putem

MATERIJALI I METODE • • Statistička metodologija. U statističkoj obradi podataka korišćene su metode deskriptivne i analitičke statistike. Od metoda deskriptivne statistike korišćeni su relativni brojevi, mere centralne tendencije i mere varijabiliteta. Od mera centralne tendencije korišćena je aritmetička sredina i medijana, a od mera varijabiliteta standardna devijacija, interval i koeficijent varijacije. Od metoda analitičke statistike korišćeni su testovi za procenu značajnosti povezanosti i razlike. Od testova za procenu značajnosti povezanosti korišćen je test jednostruke linearne povezanosti (Pearson) za parametarske, odnosno test korelacije ranga (Spearman) za neparametarske podatke. Za procenu značajnosti razlike korišćen je χ2 test u slučajevima kategorijskih podataka, odnosno u slučajevima intervalnih podataka koji ne slede normalnu distribuciju test sume rangova (Mann. Whitney) za nezavisne uzorke, tj. test ekvivalentnih parova (Wilcoxon) za zavisne uzorke. Za standardizaciju nivoa statističke značajnosti vrednost je bila 0. 05, a visoke statističke značajnosti 0. 01. U obradi podataka korišćen je statistički paket SPSS for Windows 17. 0

REZULTATI • Studija je obuhvatila 46 ispitanika, prosečne životne dobi 63± 11 (34 -82) godine • Nije detektovana statistički značajna razlika u pogledu godina života među grupama ispitanika (t=0. 689; df=44; p>0. 05) • Grafik 1. Prikaz distribucije ispitanika prema polu POL MUŠKI ŽENSKI

REZULTATI • Grafik br. 2. Distribucija primarne lokalizacije KRK-a u ispitivanoj populaciji 18 16 14 cekum 12 ascedens 10 descedens 8 sigma 6 rektum 4 2 0 grupa 1 grupa 2

REZULTATI • Grafik br. 3. Distribucija metastatske bolesti u ispitivanoj populaciji 18 16 14 jetra 12 multipla lokalizacija pluća 10 8 6 4 2 0 grupa 1 grupa 2

REZULTATI • Grafik br. 4. Distribucija metastatske bolesti prema polu 16 14 12 10 muškarci 8 žene 6 4 2 0 jetra pluća multipla lokalizacija

REZULTATI • Tabela br. 7. Distribucija frekvencija ispitanika po Dukesovoj klasifikaciji u grupi pacijenata lečenih adjuvantnom HT Histološki stadijum n % Dukes B 5 26. 3 Dukes C 14 73. 7 ∑ 19 100 bolesti

REZULTATI • Tabela br. 8. Protokoli adjuvantne hemioterapije Protokol Adj. HT n % 5 FU/LV 16 84. 2 FOLFOX 2 10. 5 Xeloda 1 5. 3 ∑ 19 100

REZULTATI • Tabela br. 9. Protokoli s. HT u ispitivanoj populaciji Protokol sistemske HT n % 5 FU/LV 12 26. 1 FOLFOX 32 69. 6 FOLFIRI 2 4. 3 ∑ 46 100

REZULTATI • Grafik br. 4. Prikaz ispitanika po broju ciklusa sistemske hemioterapije II ciklusa FOLFIRI IV ciklusa FOLOX 5 FU/LV VI ciklusa 0 5 10 15 20 25 30 35

REZULTATI • Procena ishoda sistemske HT vršena je nakon poslednjeg ciklusa HT, a definisana je kao progresija bolesti kod 22 (47. 8%), stabilna bolest kod 11 (23. 9%) i parcijalna regresija kod 13 (28. 3%) ispitanika • Nije bilo statistički značajne razlike među grupama ispitanika u pogledu ishoda (χ2=1. 176; df 2; p>0. 05)

REZULTATI • Tabela br. 10. Apsolutni broj leukocita, relaltivni broj neutrofila i limfocita, kao i NLR pre i posle s. HT. Varijabla Pre sistemske HT Posle sistemske HT Apsolutni broj Le 7. 6± 1. 8 7. 0± 2. 1 [X±SD(min-max)(x 109ćel. /l)] (4. 5 -13. 0) (3. 6 -12. 0) Relativni broj Neut 62± 10 62± 11 [X±SD(min-max)(%)] (40 -85) (38 -86) Relativni broj Ly 27 28± 13 [Med(min-max)(%)] (6 -50) (10 -90) 2. 25 2. 31 NLR [Med(min-max)] P p>0. 05 (0. 8 -12. 5) (0. 8 -9. 1)

REZULTATI • Tabela br. 11. Hematocitološki podaci i NLR odnos po grupama ispitanika Varijabla Grupa 1 (n=19) Grupa 2 (n=27) 7. 07± 1. 74 (4. 5 -11. 0) 7. 97± 1. 76 (5. 2 -13. 0) 63. 1± 9. 7 (40 -85) 62. 0± 10. 5 (44 -78) 27 (6 -50) 28(14 -50) 2. 5 (0. 8 -12. 5) 2. 2 (0. 8 -5. 5) 7. 11± 2. 04 (4. 2 -11. 0) 6. 99± 2. 12(3. 6 -12. 0) 64. 9± 11. 0 (47 -86) 60. 8± 10. 5 (38 -83) 25 (10 -90) 30 (10 -47) 2. 6 (1. 3 -9. 1) 2. 1 (0. 8 -8. 3) Apsolutni broj Le pre s. HT [X±SD(min-max)(x 109ćel/l)] Relativni broj Neut pre s. HT [X±SD(min-max)(%)] Relativni broj Ly pre s. HT [Med(min-max)(%)] NLR pre s. HT [Med(min-max)] Apsolutni broj Le posle s. HT [X±SD(min-max)(x 109ćel. /l)] Relativni broj Neut posle s. HT [X±SD(min-max)(%)] Relativni broj Ly posle s. HT [Med(min-max)(%)] NLR posle s. HT [Med(min-max)]

REZULTATI • Tabela br. 12. Prikaz distribucije frekvencija ispitanika po protokolima s. HT u grupi 1 Protokol s. HT n % 5 FU/LV 1 0. 19 FOLFOX 16 84. 21 FOLFIRI 2 10. 53 ∑ 19 100

REZULTATI • Tabela br. 15. Prikaz distribucije frekvencija ispitanika po broju ciklusa s. HT u grupi 1 Broj ciklusa s. HT n % 2 1 5. 3 4 3 15. 8 6 15 78. 9 ∑ 19 100 • Tabela br. 16. Prikaz raspodele učestalosti ispitanika po ishodu nakon s. HT u grupi 1 Ishod nakon s. HT n % PD 10 52. 6 SD 3 15. 8 PR 6 31. 6 ∑ 19 100

REZULTATI • Pokazan je statistički značajan uticaj povezanosti promene NLR odnosa pre i posle s. HT i ishoda bolesti (ρ=-0. 924; p<0. 01) u grupi 1 • Ni jedan ispitanik sa PD nije imao sniženje NLR nakon s. HT, kao što ni jedan ispitanik sa PR nije imao povećanje NLR

REZULTATI • Tabela br. 17. Prikaz distribucije frekvencija ispitanika po protokolima sistemske HT u grupi 2 Protokol s. HT n % 5 FU/LV 11 40. 7 FOLFOX 16 59. 3 ∑ 27 100 • Tabela br. 18. Prikaz distribucije frekvencija ispitanika po broju ciklusa s. HT u grupi 2 Broj ciklusa s. HT n % 2 1 3. 7 4 4 11. 1 6 22 81. 5 ∑ 27 100

REZULTATI • Tabela br. 19. Prikaz raspodele učestalosti ispitanika po ishodu nakon s. HT u grupi 2 Ishod nakon s. HT n % PD 12 44. 5 SD 8 29. 6 PR 7 25. 9 ∑ 27 100

REZULTATI • Pokazan je statistički značajan uticaj povezanosti promene NLR odnosa pre i posle s. HT i ishoda bolesti (ρ=-0. 893; p<0. 01) u grupi 2 • Ni jedan ispitanik sa PD nije imao sniženje NLR nakon s. HT, kao što ni jedan ispitanik sa PR nije imao povećanje NLR

REZULTATI • Grafik br. 5. Raspodela pacijenata po grupama prema ishodu lečenja s. HT

REZULTATI • Tabela br. 20. Sumarne vrednosti promena NLR pre/posle s. HT po grupama ispitanika prema ishodu lečenja. ISHOD ∑ NLR pre/posle s. HT GRUPA 1 GRUPA 2 ∑ NLR pre s. HT 2. 861 2. 626 ∑ NLR posle s. HT 4. 318 3. 868 ∑ NLR pre s. HT 3. 383 2. 920 ∑ NLR posle s. HT 2. 350 2. 425 ∑ NLR pre s. HT 4. 371 3. 701 ∑ NLR posle s. HT 2. 098 1. 624 PD SD PR

REZULTATI • Tabela br. 21. Statistička značajnost promena praćenih varijabli pre i posle s. HT u odnosu na ishod bolesti kod svih ispitanika Praćene varijable u odnosu PD (n=22) SD (n=11) na ishod bolesti Aps. broj leukocita pre/posle s. HT Rel. broj neutrofila pre/posle s. HT Rel. broj limfocita pre/posle s. HT NLR pre/posle s. HT PR (n=13) t= - 2. 431 t= 3. 806 t= 3. 008 (p<0. 05) (p<0. 01) t= - 8. 225 t= 1. 749 t= 7. 214 (p<0. 01) Z= - 3. 398 (p<0. 01) Z= - 4. 107 (p<0. 01) (N. S) Z= - 2. 194 (p<0. 05) Z= - 2. 268 (p<0. 05) (p<0. 01) Z= - 3. 183 (p<0. 01) Z= - 3. 184 (p<0. 01)

REZULTATI • Posle evaluacije nakon sprovedene s. HT konstatovano je ukupno 22 PD, 13 PR i 11 SD metastatskog oboljenja • U odnosu na praćene varijable pokazan je visokostatistički značaj promene NLR odnosa pre/posle s. HT i ishoda kod pacijenata koji su postigli progresiju i parcijalnu remisiju metastatskog oboljenja • U grupi pacijenata koji su postigli stabilizaciju bolesti promena NLR odnosa u odnosu na ishod bolesti postoji, ali nije visokostatistički značajna

DISKUSIJA • Migracija leukocita je jedan od ključnih događaja u inflamatornom odgovoru na tumor. Tumor oslobađa specifične hemokine koji kontrolišu ovu migraciju i funkciju ovih ćelija nakon njihovog dolaska u tumorsku mikrookolinu • Sve je veći broj dokaza da kancerogeneza i progresija tumora rezultuju u kvalitativnim i kvantitativnim promenama mijelopoeze • Kancerom uzrokovana mijelopoeza karakteriše se nagomilavanjem mijeloidnih ćelija u različitim fazama diferencijacije, što rezultuje supresijom imuniteta domaćina i promociji angiogeneze tumora

DISKUSIJA • Mijeloidne ćelije su najbrojnijie hematopoetske ćelije sa jedrom u ljudskom telu i predstavljaju grupe ćelijskih populacija sa različitim funkcijama • Tri grupe krajnje diferentovanih mijelodinih ćelija ( makrofagi, dendritične ćelije i granulociti) su esencijalne za normalnu funkciju i urođenog i stečnog imuniteta • Tumorska mikrookolina alteriše mijeloidne ćelije i konvertuje ih u potentne imunosupresivne ćelije • Ove ćelije se nazivaju mijeloidne izvedene supresorke ćelije (“myeloid-derived supresor cells”- MDSC) , imaju snažan imunosupresivni efekat i potiču iz koštane srži • Cirkulišući neutrofili sadrže i luče većinu cirkulišućih faktora rasta za koje se smatra da igraju ključnu ulogu u razvoju tumora

DISKUSIJA • Odnos neutrofil/limfocit iz uzorka krvi je identifikovan kao potencijalno koristan marker inflamacije za prognozu ishoda u različitim oboljenjima uključujući kardiovaskularna oboljenja i gastrointestinalne tumore • Povišena vrednost cirkulišućih neutrofila vrši nepovoljni efekat na nosioca tumora, na šta ukazuje negativna korelacija između broja cirkulišućih neutrofila I preživljavanja bolesnika • NLR se može posmatrati kao ravnoteža između proinflamatornog statusa tumora I antitumorskog imunog statusa domaćina

DISKUSIJA • Pacijenti sa povišenim NLR imaju relativnu limfocitopeniju I neutrofiliju, što ukazuje da ukoliko je balans pomeren u korist proinflamatornog odgovora tumora onda je udružen sa lošim onkološkim ishodom • NLR se ispituje kao prognostički-prediktivni parametar u različitim tipovima kancera • Neutrofil/limfocit odnos kao marker sistemskog zapaljenja nije ispitivan u kontekstu ishoda nakon primenjene sistemske hemioterapije u metastatskoj bolesti KRK-a

ZAKLJUČCI • Sprovedena je prospektivna studija na Službi medikalne onkologije KBC Zemun na ispitivanoj populaciji od 46 ispitanika sa m. KRK. • Kod svih ispitanika je prvobitno sproveden hirurški tretman. • Observrane su dve grupe ispitanika prosečne životne dobi 63± 11 godina. • Kod prve grupe ispitanika (Dukes B i C, n=19), sproveden je tretman a. HT. Tokom praćenja, zbog progresije bolesti u m. KRK, započet je tretman s. HT-om. Kod druge grupe ispitanika (Dukes D, n=27), odmah je započeta s. HT. • Nakon sprovedene s. HT konstatovano je ukupno 22 progresije, 13 parcijalnih remisija i 11 stabilizacija metastatskog oboljenja • Nije bilo statistički značajne razlike između opštih karakteristika pacijenata i praćenih hematocitoloških parametara (apsolutni broj leukocita, relativni broj neutrofila i limfocita). • Promena NLR odnosa značajno varira sa ishodom bolesti: ispitanici sa PD su imali povećanje NLR, dok ispitanici sa PR su imali sniženje NLR.