UNIVERSITATEA POLITEHNICA TIMIOARA STUDII MASTER EB 1 www

UNIVERSITATEA POLITEHNICA TIMIŞOARA STUDII MASTER EB 1

www. medinfo. umft. ro/dim/bioin formatica. htm 2

BIOINFORMATICA STRUCTURALA - II Prof Dr George I Mihalaş UMF Victor Babeş 3

CURSUL 3 4

Planul cursului 1. Citometria de flux – – – Principiul metodei Structura echipamentelor Interpretarea rezultatelor 2. Tehnici de secvențiere – – Secvențierea proteinelor Secvențierea acizilor nucleici 3. Alte tehnici – – Microarrays PCR 5

1. Citometria de flux Flow citometry 6

1. Fundamentare teoretică • Principiul Coulter – modificarea impedanței la trecerea unei particule printr-un orificiu îngust, într-o soluție [f(V, . . . )] • Imunofluorescnța – activare pe anticorpi By Reimar Spohr - Own work, CC BY-SA 3. 0, https: //commons. wikimedia. org/w/index. php? curid=16938198 7

2. Potențialul celular - determinare – microelectrozi (~1 μm): ~ -60 - -90 m. V (- int. ) - explicație: canale membranare pentru ioni (Na+, K+, Cl-): int ext Tendinta Na+ 5 140 ΔE: e i ΔC: e i K+ 150 10 ΔE: e i ΔC: i e ~ 0 Cl- 5 100 ΔE: i e ΔC: e i ~ 0 - dar: PNa << PK ~ PCl pompa Na+ K+, cu consum ATP 8

3. Structura unui flow-citometru • • Sursa fluxului – fascicul lichid Sistem de măsurare (impedanță) Sisteme optice Detectoare 9

• Sistemele optice - lămpi, lasere • • Ar, red. He. Ne, green. He. Ne, He. Cd, leds Detectoare lumina difuzată, CAD 10

4. Aplicații (diagnostic) - numărare de celule - sortare celulară - detecție biomarkeri - inginerie proteică 11

2. Tehnici de secvențiere 12

2. 1. Secvențierea proteinelor 1. Structura proteinelor 2. Determinarea compoziției în aminoacizi (aa) • • • 3. 4. 5. Hidroliza (”digestie”, proteaze) Separare – tehnici cromatografice (partiție între faze) Analiza cantitativă (markeri: culoare, fluorescență) Analiza aa N-terminal Analiza aa C-terminal Degradarea Edman • Fragmentare în lanțuri sub 50 aa 6. Spectrometrie de masă 7. Predicție din secv. ADN 13

2. 2. Secvențierea acizilor nucleici 1. Structura acizilor nucleici 2. Secvențierea Sanger (”chain-termination”) 16

2. Secvențierea Sanger (cont. ) - marcare radioactivă sau fluorescentă - separare: cromatografie / electroforeză capilară 3. Metode avansate și secvențiere de novo - secvențierea ”shotgun” - metode HTP (”High-Through. Put)

3. Alte metode 19

3. 1. Microarrays 1. Definiție: colecție de probe f. mici (10 -12 moli) pt. a măsura ”expresia” unor molecule 2. Tipuri: ADN/ARN, proteine, gene 3. Microarrays ADN 20

4. Microarrays proteine 21

3. 2. PCR - Polymerase Chain Reaction Definiție: amplificarea unei porțiuni ADN înafara celulei 22

23

PAUZA 24