Universitatea de Medicin i Farmacie Victor Babe Timioara

Universitatea de Medicină şi Farmacie “Victor Babeş” Timişoara REGLAREA EXPRESIEI ENZIMELOR ANTIOXIDANTE LA PACIENŢII DIABETICI PRIN TERAPII INTEGRATIVE Florina – Maria Andrica Florina Ardelean Prof. univ. Dr. Simona Drăgan

Cuprins I. Premisele studiului II. Obiective studiu III. Material şi metodă IV. Rezultate şi discuţii V. Concluzii

I. Premisele studiului Conform Federației Internaționale a Diabetului, în 2012, au fost diagnosticați cu diabet 371 milioane de pacienți şi au fost înregistrate 13 milioane de decese de cauză diabetică. Figura 1. 1 Procentul pacienților diagnosticați cu DZ tip 2 în anul 2010, respectiv 2030

I. Premisele studiului Øunul dintre cei mai importanți factori declanșatori ai DZ tip 2 Ø contribuie la accelerarea aterosclerozei, apariția leziunilor renale, a retinopatiei și a neuropatiei Figura 1. 2 Stresul oxidativ și disfuncția endotelială

I. Premisele studiului Principalele enzime cu rol în detoxifiere 1. superoxid dismutaza (EC SOD) distruge radicalii superoxid transfor mân du iîn peroxid, care pot fi inactivaţi de către catalază sau GPx 2. catalaza (CAT) este o enzimă eficientă ce nu poate fi saturată de H 2 O 2 indiferent de concentraţia compusului şi care protejează celulele de peroxidul de hidrogen 3. glutation peroxidaza (GPx) catalizează reducerea a o serie de hidroperoxizi şi astfel protejează celula mamiferelor de distrugerea oxidativă

I. Premisele studiului Polifenoli Săruri minerale (K, Ca, Fe, P) Fibre Vitamina C, cpx B, PP Proteine

II. Obiective studiu Studiul analizează influenţa dietei şi a oțetului balsamic îmbogățit cu extract de coacăze negre asupra expresiei ARNm a enzimelor antioxidante (ECSOD, GPx, CAT) la 2 loturi de pacienţi diabetici versus un lot control.

III. Material şi metodă Aliment funcţional Oţetul balsamic de mere îmbogăţit cu extract de coacăze negre

III. Material şi metodă Componente bioactive: Catechină Acid galic Epicatechină Acid cumaric Epigalocatechină Acid cafeic

III. Material şi metodă Metoda Folin - Ciocâlteu: Polifenolii, datorită grupărilor –OH inserate pe nucleul benzenic, au proprietati redox, putând fi oxidati de reactivul Folin-Ciocâlteau (Na 2 Wo 4 / Na 2 Mo. O 4) cu formarea unei coloratii albastre (Mo 4+) spectrofotometrabile la 750 nm. Concentraţia de polifenoli totali în produs = 36 mg/10 ml

III. Material şi metodă Analiza HPLC a polifenolilor din produsul total: Concentraţiile polifenolilor prezenţi în produsul total sunt: Ø antociani = 2000 ppm Ø flavanoli/flavonoizi/catechine = 400/200/1000 ppm Ø taninuri/ pectine = 1000 ppm Acizi fenolici Catechine Compararea amprentelor digitale HPLC a oţetului balsamic de mere cu/fără coacăze negre

III. Material şi metodă Protocolul studiului clinic Grupa 1 = dieta – aport caloric 35 Kcal/kg corp/zi, constant în grăsimi şi fibre, carne 150 g/zi (pui, peşte, vită) Grupa 2 = dieta + oţet balsamic îmbogăţit cu coacăze negre Grupa 3 = control (pacienţi sănătoşi)

III. Material şi metodă Protocolul studiului clinic Se determină: Ø greutatea, indicele de masă corporală (IMC), tensiunea arterială (TA) Ø glicemia, insulina Ø lipide (CT, TG, HDL, LDL) Ø stresul oxidativ Analiza statistică: STATA 9, testul t Student Parametrii se determină la includere și după 3 luni de consum al alimentelor funcţionale, în paralel, cu urmarea dietei obișnuite pentru diabetici și cu păstrarea medicaţiei.

III. Material şi metodă Tabel 3. 1. Date referitoare la pacienţii incluşi în studiu VARIABILE VALOARE MEDIE 1. V RSTĂ (ANI) 54, 3 ± 14, 18 2. SEX M = 10, F = 10 3. GREUTATE (Kg) 89, 87 ± 4, 7 4. FUMATORI (%) 28, 6 5. INDEX DE MASĂ CORPORALĂ (Kg/m 2) 34, 25 ± 5, 8 6. GRĂSIME VISCERALĂ (cm 2) 181, 64 ± 45, 7 7. TA SISTOLICĂ (mm. Hg) 152, 5 ± 11, 6 8. TA DIASTOLICĂ (mm. Hg) 88, 5 ± 8, 8 9. GLICEMIE (mg/dl) 156, 3 ± 24, 7 10. HDL (mg/dl) 33, 8 ± 7, 1 11. TRIGLICERIDE (mg/dl) 216, 5 ± 45, 6 12. COLESTEROL TOTAL (mg/dl) 238, 7 ± 33, 4 13. LDL (mg/dl) 136, 2 ± 26, 8 14. FORM – OX (unităţi FORT) 357, 6 ± 60, 6 FORM determină concentraţiile sanguine de hidroperoxid (ROOH) = indicator al stresului oxidativ

III. Material şi metodă Medicaţie % PAT 1. statine 23, 8% 2. fibraţi 9, 5% 3. antidiabetice orale 21, 4% 4. IECA 45, 2% 5. beta – blocante 42, 8% 6. blocante ale canalelor de calciu 16, 6%

III. Material şi metodă Colectarea probei şi stabilizarea ARN 1. Colectarea probelor de sânge utilizând metode standard 2. Introducerea probelor de sânge (V<0, 5 ml) în eprubete de 2 ml, preumplute cu ARN şi amestecarea acestora 3. Depozitarea pentru mai puţin de 3 zile la temperatura camerei 40 C, sau timp mai îndelungat la 200 C Liza celulară şi izolarea iniţială a ARN-ului 1. Se centrifughează probele pentru 3 min şi se înlătură supernatantul 2. Se adaugă soluția de liză celulară şi se amestecă puternic 3. Se transferă într o eprubetă de 15 m. L şi se adaugă 200 μL soluţie acetat de sodiu 3 M 4. Se adaugă soluţia de liză celulară la un volum de aprox. 3, 8 m. L şi se amestecă 5. Se extrage cu 1, 5 m. L acid fenolic : cloroform şi se recuperează faza apoasă

III. Material şi metodă Purificarea finală a ARN-ului 1. Se completează volumul fazei apoase cu etanol 2. Se verifică aspectul soluţiei 3. Se trece soluţia printr un filtru Cartridge 4. Se spală filtrul cu 750 μl soluţie de spălat 1 5. Se spală filtrul cu 2 x 750 μl soluţie de spălat 2/3 şi se uscă pentru 1 min 6. Se diluează ARN cu o solutie preîncălzită de diluţie sau cu o apă fără nuclează

IV. Rezultate şi discuţii Tabel 4. 1. Comparaţie între grupurile de pacienţi la finalul studiului VARIABILE Gr 1 n = 10 Gr 2 n = 10 1. V RSTĂ (ANI) 52, 89 ± 1, 71 54, 25 ± 11, 08 2. SEX M = 6, F = 4 M = 4, F = 6 3. INDEX DE MASĂ CORPORALĂ (Kg/m 2) 35, 17 ± 1, 19 34, 58 ± 0, 82 35, 65 ± 9, 96 35, 13 ± 0, 78 4. CIRCUMFERINŢA TALIEI (cm 2) 115, 69 ± 2, 41 109, 13 ± 2, 12 114, 78 ± 3, 21 110, 17 ± 2, 57 5. TA SISTOLICĂ (mm. Hg) 147, 73 ± 3, 02 145, 83 ± 20, 25 6. TA DIASTOLICĂ (mm. Hg) 89, 56 ± 1, 49 88, 91 ± 10, 85 7. GLICEMIE (mg/dl) 100, 48 ± 5, 18 95, 7 ± 10, 23 8. HDL (mg/dl) 51, 13 ± 1, 69 49, 57 ± 12, 26 9. TRIGLICERIDE (mg/dl) 163, 52 ± 33, 65 152, 43 ± 28, 41 10. VFA (cm 2) 180, 12 ± 8, 1 182, 41 ± 7, 3 11. FORM – OX (unităţi FORM) 310, 17 ± 13, 53 230, 14 ± 15, 32 La Gr 2: scăderea semnificativă a glicemiei (108, 9 → 95, 7 mg/dl) (p=0. 0001) şi a TG (210, 84→ 152, 43 mg/dl) (p=0. 003)

IV. Rezultate şi discuţii Tabel 4. 2. Evoluţia antioxidanţilor solubili în apă (ASA) Grupul de studiu La includere ASA μg/ml La 3 luni: ASA μg/ml Valoarea – P Gr 1 220, 61 +/27, 92 313, 56 +/37, 09 p = 0, 05 Gr 2 280, 47 +/32, 1 238, 27 +/44, 93 p = 0, 45

IV. Rezultate şi discuţii Tabel 4. 3. Expresiile ARNm vs control GPx EC – SOD CAT Gr 1 - 4, 8433 - 4, 7316 5, 5116 ± 4, 667 ± ± 2, 1802 ± 3, 5697 0, 8225 1, 8953 Gr 2 - 0, 948 - 1, 1633 2, 6220 ± 1, 8220 ± - 0, 018 ± 2, 2391 ± 1, 0719 1, 7538 1, 0103 ± 1, 2281 C -3, 0766 ± 1, 2721 4, 7467 ± 1, 3211 La Gr 1: Ø scăderea semnificativă a expresiei ARNm a enzimei antioxidante EC – SOD (p=0. 012) Ø modificări nesemnificative a expesiilor enzimelor antioxidante GPx şi CAT - 0, 9016 - 0, 7983 ± 1, 5150 ± 2, 0967 - 0, 012 ± 1, 4453 0, 4616 ± 1, 5657

IV. Rezultate şi discuţii La Gr 2: scăderea semnificativă a tuturor celor 3 enzime antioxidante: CAT (p=0, 02), GPx (p=0, 044) şi EC – SOD (p=0, 001). Figura 4. 1. Expresiile ARNm pentru grupul 2

IV. Rezultate şi discuţii 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Gr 1 Gr 2 la includere la 3 luni Figura 4. 2. Evoluţia u. FORT Cea mai semnificativă reducere a stresului oxidativ s-a observat la Gr 2 de la 2354, 87 la 230, 14 u. FORT (p=0. 0002).

V. Concluzii 1. Rezultatele obținute în urma acestui studiu demonstrează siguranţa, tolerabilitatea şi eficacitatea extractului bioactiv bogat in polifenoli, care a fost utilizat în reglarea homeostaziei glucozei și a parametrilor sindromului metabolic la diabetici. 2. Produsul studiat a redus semnificativ stresul oxidativ, care s-a dovedit a fi un factor foarte important în fiziopatologia DZ tip 2. 3. Reducerea expresiei tuturor celor trei ARNm sugerează faptul că antioxidanții din dietă au contribuit la neutralizarea speciilor oxidative. 4. Pacienții diabetici ar trebui să folosească produse funcționale în dieta lor zilnică, atât pentru a optimiza efectul medicamentelor recomandate de către protocoalele clinice, cât și pentru a obține un control metabolic mai bun.

Vă mulţumesc !