UNIVERSITA DEGLI STUDI TOR VERGATA CORSO DI LAUREA

UNIVERSITA' DEGLI STUDI TOR VERGATA CORSO DI LAUREA PER TECNICI DI LABORATORIO BIOMEDICO I Controlli di Qualità nel Laboratorio Analisi (Nozioni di base) Dott. Luciano Ciccarone Rev. 4 Aggiornata al 09/04/2011

NOZIONI DI BASE La ripetizione di un campione o controllo di qualità a titolo noto o ignoto, tende nel tempo ad assumere la forma campanulare o curva simmetrica o gaussiana. La distribuzione gaussiana è simmetrica rispetto alla media ed è completamente definita dalla media e dalla deviazione standard. Nella distribuzione normale o gaussiana, la mediana e la moda coincidono. 2

NOZIONI DI BASE Nel presupposto di una distribuzione normale o gaussiana, ci si attende che circa il 68% dei dati cada entro 1 D. S. dalla media, il 95% entro 2 D. S. dalla media e il 99. 7% entro 3 D. S. dalla media. Pertanto risulta molto improbabile (0. 3%) osservare un valore di controllo oltre le 3 D. S. rispetto alla media vero problema con il metodo. Oltre le 2 D. S. corrisponde ad una probabilità del 5% vero problema o falso allarme. Roma, 06/09/2010 3

NOZIONI DI BASE 4

NOZIONI DI BASE Coefficiente di variazione (CV%) È una misura della variabilità, indica l’imprecisione come valore percentuale rispetto al valore medio supposto vero: è un indice, quindi, dell’accuratezza: è un grandezza adimensionale che ci consente di comparare distribuzioni con valori ed unità di misura molto differenti : CV% = / x 100 (= D. S. / M x 100 ) da cui D. S. =(CV%* media)/100 Quindi: La precisione è la concordanza fra determinazioni ripetute, mentre l’accuratezza è la concordanza con il valore “vero”. 5

X X X XX X X X X X X X X XX Preciso ma con BIAS Accurato ma impreciso. Accurato e preciso LS Problemi di accuratezza Problemi di precisione LI Performance stabile 6

I due errori analitici combinati X X X Imprecisione (CV%) X X X X X X ESATTEZZA x BIAS (ACCURATEZZA) VALORE VERO DEL MISURATO (Convenzionale) Spesso si parla di accuratezza al posto di esattezza 7

Concetti fondamentali di metrologia Il controllo della qualità analitica è un’attività fondamentale per assicurare l’affidabilità dei referti di laboratorio: senza qualità analitica, infatti, il referto non è utile o, peggio, può essere dannoso. Il controllo di qualità utilizza sostanzialmente alcune tecniche statistiche per valutare alcune grandezze metrologiche, di cui conviene conoscere le definizioni essenziali. 8

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Definizioni metrologiche Esattezza: è il grado di concordanza tra il risultato della misurazione ed il valore vero del misurato. Alla conoscenza del valore vero, che può essere considerato un concetto astratto, non misurabile in pratica, ci si può solo arrivare con metodi privi di errore sistematico (metodi definitivi) e, in ogni caso, si riesce ad avere solo la stima del valore vero, in funzione della imprecisione e del numero di replicati delle misure. In altre parole ci si riferisce al valore vero come ad un valore convenzionale. L’esattezza (spesso utilizzato il termine improprio di accuratezza) è quantificata dall’incertezza e rappresenta l’errore totale. E’ legata alla combinazione di effetti sistematici ed effetti casuali che contribuiscono all’errore di misura. 10

Definizioni metrologiche …segue L’ ACCURATEZZA è il grado di concordanza tra la media delle misurazioni ed il valore vero del misurato, è descritta in termini di scostamento, BIAS = differenza tra il risultato (media) delle misurazioni ed il valore vero (o di consenso) del misurando. Questa differenza (Bias) può essere espressa sia in unità di misura sia come percentuale rispetto al valore vero. (IM)PRECISIONE : corrispondenza tra i singoli replicati in una serie di misure. La precisione non ha un valore numerico ma è quantificata dall’imprecisione. IMPRECISIONE : indicazione quantitativa della dispersione casuale (come la deviazione standard, il coefficiente di variazione o l’intervallo) di una 11 serie ripetuta di misure. Deve essere indicato il valore

Definizioni metrologiche…segue RIPETIBILITA’ : grado di concordanza tra risultati di successive misurazioni dello stesso misurando, effettuate nelle stesse condizioni di misura : La medesima procedura di misurazione Lo stesso osservatore Lo stesso strumento di misura usato nelle stesse condizioni Il medesimo luogo La ripetizione deve avvenire in un periodo breve RIPRODUCIBILITA’ : grado di concordanza tra risultati di misurazioni dello stesso misurando effettuate variando le condizioni di misura. Una valida dichiarazione della riproducibilità richiede la specificazione delle 12

Definizioni metrologiche…segue CALIBRAZIONE : la serie di operazioni che stabilisce, in condizioni specificate, la relazione tra i valori indicati da uno strumento e i corrispondenti valori noti di un analita. SENSIBILITA’ ANALITICA : pendenza della curva di calibrazione LIMITE DI RILEVAZIONE: minimo risultato che può essere distinto con una probabilità stabilita, da un adeguato “bianco”. Il limite stabilisce il punto al quale l’analisi diventa possibile e può differire dal limite di determinazione. CONTROLLO DI QUALITA’ INTERNO : attività e tecniche utilizzate nel Laboratorio per soddisfare i requisiti di qualità, è utilizzato per 13 stabilire se i

D. O. Campo di determinazione 10 en s ib ili tà M ag gi o r s Limite di quantizzazione Limite di rilevazione 3 Limite di linearità Concentrazione 14

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NELLA PRATICA DEI LABORATORI CLINICI Lo. D (Limite basso di detenzione) = Media del bianco + 3 D. S. del Bianco Lo. Q (Limite basso di quantificazione) = Media del bianco +10 D. S. del Bianco Per calcolare la media del bianco sono necessarie dalle 20 alle 60 misurazioni Il Lo. D è la concentrazione più bassa di analita in corrispondenza della quale si ottiene segnale per tutti i replicati del dosaggio. 16

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La calibrazione Si esegue utilizzando degli standard a titolo noto, forniti abitualmente dal fornitore della strumentazione analitica. Quando il calibratore utilizzato è uno solo, per definire la retta di calibrazione, viene utilizzato il bianco reattivi, anche se ciò non è molto corretto ! Il controllo della calibrazione avviene verificando che il valore del calibratore/i rientri/ino nel range fornito dal fornitore della strumentazione. 18

La retta di calibrazione Y=ax+b D. O. a: slope o coeff. angolare b: intercetta su y Range del 2° calibratore Range del 1° calibratore 25 100 Concentrazione nota dei calibratori 19

Nozioni di base • La premessa per ogni determinazione è la definizione e verifica della curva di calibrazione. • I controlli di qualità possono darci la garanzia del mantenimento di una corretta curva di calibrazione. • La calibrazione va eseguita periodicamente secondo le prescrizioni del fornitore dello strumento / metodica e/o in caso di controlli anomali. 20

La validazione del metodo analitico I metodi di analisi devono essere validati: • prima della loro introduzione in routine; • ogni volta che cambiano le condizioni per le quali il metodo è stato convalidato (ad esempio, uno strumento con caratteristiche diverse o campioni con una matrice diversa), • ogni volta che il metodo è cambiato e il cambiamento è al di fuori delle caratteristiche iniziali del metodo. 21

La pianificazione della validazione comporta: • Sviluppare un protocollo di convalida, una procedura operativa o un master plan di validazione della metodica. • Sviluppare un piano di progetto. • Definire gli attori e le responsabilità. • Definire l'applicazione, finalità e ambito di applicazione del metodo. • Definire i parametri di performance e criteri di accettazione 22

La pianificazione • Definire gli esperimenti di convalida • Verificare le caratteristiche di prestazione delle strumentazioni o attrezzature • Identificare le caratteristiche del materiale da utilizzare (standard, controlli, materiali, ecc. ) • Definire I tempi previsti per le conclusioni Altri requisiti li vedremo a livello di applicazione. Ogni struttura, laboratorio, azienda deve avere una procedura gestionale che definisca la validazione di una nuova metodica / strumentazione (ISO 9001 req. 7. 3 : Progettazione e sviluppo). 23

Pertanto, tutti i metodi analitici non commerciali devono essere validati prima della loro introduzione in routine (inclusi alcuni dosaggi di analiti critici in kit e le variazioni a kit commerciali) con le seguenti definizioni: Linearità: dedotta dalla retta di calibrazione in base alla regressione polinomiale. Limite di rilevazione: definito come la più bassa concentrazione di un analita che può essere distinta dal background (zero analitico o biologico) con il 99% di confidenza (+3 DS sopra la media dello zero analitico o biologico). (Im)precisione, ottenuta dalla misura dei coefficienti di variazione nel giorno e fra giorni a tre differenti livelli di concentrazione. Se si utilizza nuova strumentazione, l’imprecisione analitica misurata deve essere conforme alle specifiche tecniche del costruttore, che ne hanno dettato la scelta. Accuratezza, ottenuta dalla misura della deviazione percentuale (Bias) rispetto a materiali di riferimento. 24

Altre definizioni metrologiche V. E. Q. (Verifica Esterna di Qualità) in USA : (Laboratory proficiency Testing): determinazione delle prestazioni di laboratorio tramite confronto interlaboratori. ERRORE CASUALE (Ec) = differenza tra il risultato di una misurazione (x) e la media (M) che risulterebbe da un infinito numero di misurazioni del medesimo misurando effettuate in condizioni di ripetibilità: Ec=x-M ERRORE SISTEMATICO (Es) = differenza tra la media che risulterebbe (M) da un numero infinito di misurazioni dello stesso misurando , effettuate in condizioni di ripetibilità e il valore vero (V) del misurando : Es=V-M 25

Cifre significative Come mai esprimiamo le transaminasi con valori che non comprendono i decimali mentre esprimiamo l’urato con 1 decimale? Esiste (in base alle unità di misura utilizzate), una specifica significatività del valore riportato, legata al livello di sensibilità della metodica analitica e non ha senso utilizzare un maggior numero di decimali ! Per fare un esempio il glucosio espresso in mg/dl, è corretto arrotondarlo all’ unità (98 mg/dl). Se invece è espresso con il Sistema SI (5. 4 mmol/L), necessita di almeno un decimale e non di più (f. c. = 0. 05551). 26

La pianificazione dei Controlli di Qualità A) Definire la qualità necessaria B) Misurare la qualità analitica del sistema in uso C) Scegliere i sistemi di controllo D) Definire e documentare gli interventi correttivi Al fine del controllo di qualità vengono misurate l’imprecisione e lo scostamento (BIAS), ma è ovvio che è di grande rilevanza anche la specificità e la resistenza (ROBUSTEZZA) del metodo alle interferenze. Le prestazioni del metodo di analisi sono fortemente condizionate dalla scelta iniziale: se il metodo è di scarsa qualità, sarà difficile ottenere buone prestazioni anche con il massimo impegno. Questo fatto è spesso sottovalutato ritenendo che accuratezza e precisione possano essere sufficienti garanzie di un controllo di metodo. 27

A) La qualità necessaria 1. Valutazione dell’effetto delle prestazioni analitiche sull’esito clinico in situazioni cliniche specifiche 2. Valutazione dell’effetto delle prestazioni analitiche sulle decisioni cliniche in generale: a) Dati basati sui componenti della variabilità biologica b) Dati basati sull’analisi dell’opinione dei clinici 3. Raccomandazioni professionali: a) Da gruppi di esperti nazionali o internazionali b) Da gruppi di esperti locali o singoli professionisti 4. Obiettivi di prestazioni stabiliti da: a) Organismi di controllo b) Organizzatori di programmi di Valutazione Esterna di Q. (VEQ) 5. Obiettivi basati sullo stato dell’arte: a) Sulla base dei dati di programmi VEQ o similari b) Sulla base dei dati relativi alle tecniche analitiche (pubblicati). 28

La qualità pianificata La D. S. per ogni metodica è una derivata della imprecisione analitica (CV%) stabilita dal responsabile del laboratorio, tenendo conto dell’imprecisione massima necessaria al clinico e delle caratteristiche delle strumentazioni in uso. D. S. =(CV%* target)/100 Pertanto il range riportato nei controlli a titolo noto, non ha alcuna relazione con le D. S. che devono essere calcolate e impostate nelle carte dei controlli di qualità o carte di Lewey-Jennings. 29

Esempio CQ s-Glucosio Dati allegati al CQ l. normale (fornitore) 120 mg/d. L 2 DS 100 mg/d. L T 80 mg/d. L -2 DS CV%= 10/100 *100 = 10 CV% Desiderabile e raggiungibile previsto dal Primario = 3 106 mg/d. L 2 DS 100 mg/d. L 94 mg/d. L T -2 DS DS= 3*100 /100 = 3 30

Traguardi analitici per il clinico La qualità analitica desiderata dal clinico deriva dalla variabilità biologica intraindividuale (CVI) e interindividuale (CVG): NON SEMPRE E’ RAGGIUNGIBILE. A) Intraindividuale (CVI) = ampiezza delle oscillazione di una grandezza di un individuo attorno ad un punto omeostatico. B) Interindividuale (CVG) = variabilità dei valori assunti dal punto omeostatico nei diversi individui. 31

Un esempio pratico La variabilità biologica intraindividuale della glicemia è del 5. 8 %. Se il risultato della glicemia di un soggetto è 110 mg /d. L vuol dire che abitualmente potrebbe avere ± 5. 8% (103. 62 -116. 38). Ma anche il dato da noi fornito ha una imprecisione analitica. Per dare significatività al dato fornito dovrò avere al massimo 5. 8 /2 = 2. 9 di CV%. Traguardo analitico raggiungibile 32

La variabilità biologica Il nostro risultato, già affetto da errori per variabilità analitica (CVA = CV%), va poi ad interagire con la variabilità biologica : Per cui la variabilità totale (CVT) associata ad un valore osservato in un paziente diventa: (CVT) = 2 ( CVA + CVI 2 Ove, presupposto di qualità ) CVA max. = ½ CVI = 1/4 CVG E’ necessario che la (CVA ) non aumenti troppo la (CVT) oltre il valore di (CVI) Se (CVA ) ≤ 0. 25 (CVI) (CVT) ≤ 1. 03 (CVI) traguardo ottimale ((CVI) +3%) Se (CVA ) ≤ 0. 5 (CVI) (CVT) ≤ 1. 12 (CVI) traguardo desiderabile ((CVI) +12%) Se (CVA ) ≤ 0. 75 (CVI) (CVT) ≤ 1. 25 (CVI) traguardo minimo ((CVI) +25%) Per esempio se un analita ha una CVI (var. biologica intra individuale) di 8. 6%, il traguardo d’imprecisione CVA a livello desiderabile dovrà essere di 4. 3% 33

Il traguardo di accuratezza (BIAS) a livello desiderabile 2 sarà: 0. 25 * (CVI + CVG 2 ) ( 0. 125 liv. ottimo, 0. 375 liv. Sufficiente) Pertanto l’errore massimo accettabile (Eta) al 95% sarà: 2 0. 25 * (CVI + CVG 2 ) + (0. 50 CVI * 1. 65) 34

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Traguardi d’imprecisione e Bias Per fortuna dei meno esperti in matematica, i traguardi analitici (imprecisione e BIAS) basati sulla variabilità biologica, sono reperibili in numerose pubblicazioni scientifiche. Ricordo che il livello d’imprecisione analitica a livello desiderabile (dai clinici) non sempre è raggiungibile 36

UN ESEMPIO PRATICO (solo alcuni analiti) TARGET D'IMPRECISIONE ANALITICA (CV%) da cui impostare DS per le carte di Lewey Jenning Chimica e Prot. Specifiche CV% ANALITA Necessari al clinico (SIBIOC) Raggiungibili 016 CALCIO_2 1, 00 2, 40 017 Phos 4, 30 022 FE 2 13, 30 018 MG 1, 80 028 CO 2 ? 046 Lact 13, 60 197 Na 0, 40 198 k 2, 40 199 Cl 0, 60 014 NEFA ? 204 ASO_2 ? 020 wr. CRP 26, 30 209 TRANSF 1, 50 206 F REUMA 4, 30 573 FERRIT 7, 50 Nostri Impostati su strum x D. S. 2, 0 5, 0 10, 0 5, 0 3, 40 6, 0 1, 40 1, 60 5, 0 1, 5 2, 4 1, 5 8, 0 3, 50 2, 70 9, 50 6, 0 8, 0 5, 0 3, 0 5, 0

La variabilità biologica Per quanto finora detto, più è variabile un analita nella popolazione, più errore analitico totale è consentito, più è bassa la variabilità biologica più deve essere bassa la variabilità analitica. Es: variabilità totale in funzione della variabilità analitica per diverse variabilità biologiche: 40% Vb 2. 5 % Vb 5. 0 % Vb 10 % Vb 15 % CVTotale 20% 10% 38

B) Misurare la qualità analitica del sistema in uso BIAS e IMPRECISIONE sono influenzati dai seguenti fattori: I fattori esterni permanenti (metodo analitico, strumenti, reagenti, calibratori) I fattori interni permanenti (condizioni analitiche) I fattori esterni variabili ( legati alla produzione dei lotti) I fattori interni variabili (procedure, addestramento degli operatori) 39

BIAS e valori di riferimento. . . segue Considerato che la maggior parte dei valori di riferimento per ogni metodica e strumentazione sono abbastanza ben definiti in letteratura, a fronte di ripetuti e frequenti valori extra-limite, le conoscenze cliniche aiutano molto a capire se è un problema legato alla nostra popolazione o esclusivamente al BIAS. Quindi l’imprecisione analitica è più facile da controllare e garantire rispetto al BIAS (scostamento dal valore vero) e comunque eventuali variazioni del BIAS sono molto più critiche in quanto cambiano i limiti decisionali dei clinici ed aumentano il numero delle ripetizioni analitiche richieste. Media dei “normali”, analisi dei soggetti selezionati, Analisi di una miscela di campioni di soggetti selezionati, sono approcci validi per la valutazione del BIAS. 40

BIAS e valori di riferimento • Ai fini clinici, è necessario che vi sia un parallelismo e correlazione tra il BIAS ed i valori di riferimento valore vero valore misurato Es. AST valore vero 30 (v. d. rif. 0 -40 U/L) misurato 42 (v. d. rif. 20 -60) 41

EFFETTI DELL’IMPRECISIONE Valori di riferimento 42

A’ a Sensibilità a+b / Specificità c % dei malati con test positivo % dei sani con test negativo c+d Non malattia CUT OFF + Specificità d Malattia V- a V+ F- F+ b SKIP c 43

ALTRO ESEMPIO DI RAPPRESENTAZIONE: i BOX PLOT Valori 44

• • • Sensibilità: probabilità che un test sia positivo quando è presente malattia. Specificità: probabilità che un test sia negativo in assenza di malattia Rapporto di probabilità dei positivi: V+ / F+ Rapporto di probabilità dei negativi: F- / VValore predittivo dei pos. : probabilità di malattia quando il test è positivo Valore predittivo dei neg. : probabilità di assenza di malattia quando il test è negativo LINK 45

Malattia TEST Presente Assente + V+ 250 F+ 40 290 - F- 50 V- 100 150 140 440 Totale 300 TOTALE PREVALENZA = 300 / 440 = 0. 682 SENSIBILITA’ = 250 / 300 = 0. 83 SPECIFICITA’ = 100 / 140 = 0. 71 Val. predittivo dei + 250 / 290 = 0. 862 Val. predittivo dei – 100 / 150 = 0. 75 LINK 46

Malattia TOTALE TEST Presente n° Assente n° N° + V+ a F+ c a+c - F- b V- d b+d Totale a+b c+d a+b+c+d 47

Sensibilità = a / (a+b) Specificità = c / (c+d) Rapporto di Sensibilità Rapporto di 1 -Sensibilità probabilità = 1 -Specificità dei Sensibilità dei + Valore predittivo dei + = a / (a+c) Valore predittivo dei - = d /( b+d) 48

L’errore totale… segue Senza addentrarci troppo in formule complicate dobbiamo constatare che l’errore totale è la risultante dei due effetti combinati dell’imprecisione ed accuratezza (BIAS). Per definire la qualità desiderata ci si deve riferire all’errore totale ammesso. Per fortuna dei poco esperti in matematica, i traguardi analitici nelle diverse pubblicazioni li troviamo già scomposti nelle due componenti: CV% max BIAS % Albumina 1. 4 1. 1 Bicarbonato 2. 3 1. 6 Bilirubina 11. 3 9. 8 Calcio 0. 9 0. 7 Cloruri 0. 7 0. 5 49

CV% max BIAS % Colesterolo 2. 7 4. 1 Creatinina 2. 2 2. 8 Ferro 15. 9 8. 9 Fosfato 4. 0 3. 1 Glucosio 2. 2 1. 9 Magnesio 1. 1 1. 6 Potassio 2. 4 1. 6 Proteine totali 1. 4 1. 5 Sodio 0. 3 0. 2 Trigliceridi 11. 5 15. 6 Urea 6. 3 5. 3 ALT 13. 6 GGT 20. 7 21. 6 50

La variabilità biologica Il massimo errore accettabile (ETA) in base ai criteri della variabilità biologica è stato già trattato a pag. 26. Alcuni esempi aiutano a chiarire Errore casuale (CV%) sistematico(BIAS) l’interazione delle Totale ΔEC*CV ΔES*CV in % ETA CV CV I G variabili fin qui considerate : Glucosio 6. 5 7. 7 3. 3 2. 5 7. 9 Creatinina 4. 3 12. 9 2. 2 3. 4 6. 9 Sodio 0. 7 1. 0 0. 4 0. 3 0. 9 Colesterolo 6. 0 15. 2 3. 0 4. 1 9. 0 AST 11. 9 17. 9 6. 0 5. 4 15. 2 51

CONSIDERAZIONI Le misurazioni analitiche sono affette dall’errore analitico totale nelle due componenti: imprecisione analitica e Bias, alle quali si aggiunge la variabilità biologica nelle due componenti: interindividuale e individuale. Per cui i CV% da utilizzare come target per la costruzione delle carte di Lewey Jenning (D. S. ) devono essere adeguati, ove possibile, alla variabilità biologica dell’analita misurato, proprio per dare significatività al risultato. 52

Differenza critica (Dcr) E’ la più piccola variazione fra due valori successivi di uno stesso paziente, che non può essere spiegata dalla variabilità totale (CVT) e quindi va attribuita con probabilità del 95% all’intervento di fattori addizionali. Quindi bisogna escludere l’incidenza della variabilità analitica e della variabilità biologica intraindividuale. DK al 95% = 2. 77 x (ns CV%)2 + CVI 2 Solo alcune differenze maggiori del Dcr (Dk) possono essere considerate significative per variazioni delle condizioni del Per Es. Colesterolo Dk= 10% se 1° Val =220 , dopo terapia il 2° Val <200 paziente. 53

Errore critico sistematico d. SEc Indica di quante volte si può spostare la media, prima di superare i limiti delle specifiche di qualità relative all’errore analitico totale Eta. Per es. d. SEc =10 indica un metodo dove la media si può spostare di 10 D. S. prima di superare i limiti delle specifiche. d. SEc = [(ETA – BIAS)/ CV% ] – 1. 65 54

Importanza dell’ Errore critico sistematico Un metodo con d. SEc > 3 soddisfa facilmente i requisiti per la qualità e necessiterà di un semplice CQ. Se compreso tra 2 e 3, diventa più difficile il mantenimento dei requisiti di qualità e servono più controlli o regole più severe. Se < 2 occorrerà molta attenzione nei CQ in quanto il metodo è altamente instabile. 55

C) I sistemi di controllo Il controllo di qualità interno: valuta in tempo reale la stabilità del sistema analitico (errori casuali e sistematici). E’ d’obbligo la sua valutazione per la validazione della seduta analitica. La Valutazione Esterna di Qualità (VEQ): valuta la comparabilità dei risultati di più laboratori (con o senza lo stesso metodo analitico e strumentazione), è retrospettivo, quindi inadatto per la validazione della seduta analitica. 56

l Possibile causa di errori casuali (imprecisione): – Bolle d’aria o particelle nei reagenti e nelle linee di dispensazione dei reagenti, – reagenti ricostituiti/miscelati non adeguatamente, – temperatura e incubazione instabile, – linea di fornitura elettrica instabile, – variazioni individuali dell’operatore nel pipettamento, controllo dei tempi, ecc. l Regole più sensibili (maggiore potenza): • 13 s La seduta analitica non è valida • R 4 s La seduta analitica non è valida 57

l Possibile causa di errori sistematici (inesattezza): • cambio di lotto reagente / calibratore, • errati valori di calibratori, • reagenti preparati impropriamente, • deterioramento reagenti / deterioramento calibratori, • conservazione inadeguata di reagenti / calibratori, • cambio di volume campione o reagente a causa di disallineamento o staratura pipettatore, • cambio temperatura incubatori o blocchi reazione, • deterioramento fotometro o fotomoltiplicatore, • cambio di procedura da un’operatore all’altro. l Regole più sensibili (maggior potenza): • 22 s • 41 s 58

Dott. Luciano Ciccarone 59 59

Le regole (6) multirule di Westgard 12 s : Regola di allarme : Se un valore supera le +2 S rispetto alla media, bisogna considerare altri valori all’interno della seduta e tra sedute consecutive, prima di accettare la seduta e convalidare il risultato. I Laboratori che utilizzano solo questa regola per interpretare il proprio Controllo di Qualità, rifiuteranno frequentemente sedute che sono valide. Secondo Westgard si possono registrare le seguenti percentuali di falsi rifiuti in caso di risultati validi compresi tra 2 e 3 D. S. : 5% di tutte le sedute analitiche, quando è utilizzato un solo livello di controllo 10% di tutte le sedute analitiche, quando sono utilizzati due livelli di controllo 14% di tutte le sedute analitiche, quando sono utilizzati tre livelli di controllo 13 S : Questa regola rileva un errore casuale. La violazione di 60 questa regola può anche indicare a volte un errore sistematico.

22 S : Questa regola rileva un errore sistematico. E’ applicata sia all’interno della seduta che tra sedute consecutiva. All’interno della stessa seduta questa regola è violata quando 2 valori consecutivi sono posizionati oltre le 2 S dalla stessa parte rispetto alla media (oppure 2 valori su 3, se il controllo è a 3 livelli). La regola è violata tra sedute consecutive quando due valori consecutivi di un livello superano 2 S nella stessa direzione. R 4 S : Questa regola rileva un errore casuale. E’ applicata sono all’interno della seduta. Questa regola è violata quando la differenza in termini di deviazione standard tra 2 valori dello stesso livello (o 2 valori su 3, se il controllo è a 3 livelli) supera 4 S. La seduta è considerata nulla 41 S : Questa regola rileva un errore sistematico. E’ applicata sia all’interno di un livello che tra livelli. La regola è violata all’interno di un livello quando 4 valori dello stesso livello superano 1 S dalla stessa parte rispetto alla media (media+1 S) (media-1 S). La regola è violata tra livelli quando gli ultimi 4 61 valori consecutivi tra livelli superano 1 S. Questa regola può

Le regole di Westgard. . segue 10 x : Questa regola rivela un errore sistematico ed è applicata sia all’interno del livello che tra livelli. In quest’ultimo caso la regola è violata quando gli ultimi 10 valori indipendentemente dal livello di controllo, sono dalla stessa parte delle medie relative. La regola è violata all’interno del livello quando gli ultimi 10 valori consecutivi di un livello sono dalla stessa parte della media. Se il controllo è a tre livelli, questa regola è indicata come 9 X (9 dati consecutivi); se il controllo è a 4 livelli è indicata come 8 X (8 dati consecutivi). Questa regola può non richiedere il rifiuto della seduta. Piuttosto può essere considerata un indicatore per valutare la necessità di revisione dello strumento o la necessità di 62 ricalibrazione dello strumento o del kit.

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N. B. : I punti z sono i valori di una serie espressi in unità di Deviazione Standard (D. S. ). (Valore – Media) / D. S = valore espresso come punto z Per esempio Media =100 D. S. =10 +1, 5 z = 115 -2 z = 80 La rappresentazione dei valori come punti z aiuta la valutazione dei dati e permette una facile graficazione dei valori sulle carte di Levey Jennings. Anche per le metodiche manuali l’interpretazione dei controlli di qualità deve avvenire sulle carte di Levey Jennings, applicando le regole di WESTGARD. 64

D) Definire e documentare gli interventi correttivi A fronte dei criteri stabiliti per monitorare la stabilità analitica (controlli di qualità) è d’obbligo definire, registrare e documentare gli interventi correttivi eseguiti. Definire = dire cosa va fatto se… Registrare = scrivere quel che si è fatto Documentare = dimostrare di aver registrato e firmato ciò che si è fatto. 65

Le più comuni azioni da intraprendere Ripetere il controllo Eseguire un bianco reattivi e una nuova calibrazione Sostituire i reagenti Taratura degli strumenti volumetrici Manutenzione sistema di rilevazione Ricostituzione controlli e sostituzione Verifica delle condizioni operative Verifica correlazione con altra strumentazione Accettazione / declassamento dei risultati 66

Data____ Linea Analitica_____________ Strumento______________ Analisi_________ (obbligatorio in caso di violazione R. Westgard 13 S e R 4 S) non necess Indicare regola violata_______ Interventi correttivi CQI accettato Note SI NO Ripetuto il controllo Eseguito bianco reattivi e nuova calibrazione Sostituti i reagenti Ricostituiti e sostituiti i controlli Taratura degli strumenti volumetrici Manutenzione del sistema di rilevazione dello strumento Verifica delle condizioni operative Blocco della seduta analitica Richiesta d’intervento tecnico alla Ditta competente Operatore_____ 67

Correlazione e regressione Quando si introduce una nuova strumentazione analitica è necessario verificarne non solo l’imprecisione analitica (CV%) a fronte delle caratteristiche fornite dal produttore, ma anche la corrispondenza dei valori con analoga strumentazione esistente, anche se identica. Le implicazioni che ne derivano sono evidenti per i valori di riferimento e quindi per l’interpretazione clinica del dato. I replicati dovrebbero essere almeno 20 e ricoprire il più ampio range possibile dei valori. 68

R=0. 9855 : buona correlazione per r > /0. 90/ 69

La correlazione tra due strumenti è un parametro che non può essere valutato solo in ingresso di un nuovo strumento, ma va monitorata con frequenza prestabilita in base alle caratteristiche strumentali, stabilità del metodo e tipologia del campione biologico. Se per uno stesso dosaggio utilizziamo due strumenti, magari uguali, ma uno per esempio di giorno in routine e l’altro di notte in urgenza, dobbiamo verificare che i risultati forniti siano coerenti e corrispondenti, a garanzia della riproducibilità necessaria per il mantenimento degli stessi valori di riferimento (necessari per una facile interpretazione del referto). E’ impensabile fare tutti i giorni analisi di correlazione e regressione, ma devono essere eseguiti almeno mensilmente (occasione buona potrebbe essere il giorno di esecuzione dei campioni per la VEQ). In ematologia è necessaria una correlazione giornaliera. Alcuni laboratori stabiliscono delle differenze accettabili per i diversi parametri ematologici, ma non tengono conto del valore assoluto. Per esempio WBC max differenza accettabile tra due strumenti 0. 8 x 10^9 L, ma un conto se il valore è 7. 5 altro se 21. 0 70

Registrazione giornaliera allineamento strumentazioni ematologiche WB C 1 WBC 2 WBC 3 TARGET gg 1 2 3 ID CV% RBC 1 RBC 2 RBC 3 CV% HBG 1 HBG 2 HBG 3 3. 50 1. 20 954361 8. 72 9. 1 8. 7 2. 42 3. 29 3. 38 3. 31 1. 42 9. 3 9. 7 1337975 7. 55 7. 69 7. 8 1. 39 4. 85 4. 84 0. 12 14. 3 14. 1 132655 3. 12 2. 85 2. 9 4. 73 4. 51 4. 45 4. 51 0. 77 11. 8 12 12 1353386 5. 82 5. 8 5. 5 2. 83 4. 71 4. 74 4. 68 0. 64 12. 6 12. 7 12. 8 1) XE 2100 2)ADVIA 120 3)New ADVIA 120 71

Le carte di controllo La carta di controllo vista per i CQI è definita la carta di controllo della media o di Levey e Jennings ed è la più usata nei controlli di qualità interni, mentre per la VEQ (a 2 livelli) molto utilizzato è il diagramma di Youden : 72

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Riepilogo periodico: guida alla lettura programma Immunocheck 75

• grafico cumulativo dei valori di z e dei punteggi del tuo laboratorio il punteggio medio quantifica la prestazione del tuo laboratorio n° campione, metodo, valore di z = dev% dal bersaglio/CV% stato dell’arte punteggio: 4: ottimo (|Z|<0. 5), 3: buono (0. 5<|Z|<1), 2: sufficiente (1<|Z|<2) 1: insufficiente (2<|Z|<3), 0: aberrante (|Z|>3) 76

dott. L. Ciccarone 77

Aspetti particolari in ematologia Prima dell’avvento delle strumentazioni automatiche si eseguivano i conteggi degli elementi corpuscolati in camera di Thomas o Burger, il dosaggio spettro fotometrico dell’ Hb e il microematocrito per l’Ht. Gli altri indici venivano calcolati manualmente con le seguenti formule: MCV= Ht / G. R. MCH= Hb / G. R. MCHC= Hb / Ht 78

Il controllo interparametrico dei dati Tali indici tra loro correlati, se eccessivamente elevati, ci inducevano alla ripetizione del conteggio dei G. R. , abbastanza critico rispetto alla determinazione dell’ Hb e Ht, molto più affidabili e ancora oggi metodiche di riferimento primario. L’abbandono di tali dosaggi e l’acquisizione di calibratori e controlli corpuscolati, per cui poco stabili, inizialmente resero le calibrazioni e i controlli poco accurati. Si passò dal “day to day quality control” alle medie mobili. 79

Aspetti particolari in ematologia o di Bull’s Average, oggi implementate sulla maggior parte delle strumentazioni ematologiche. Il concetto è semplice e valido per i parametri ematologici (MCV, MCHC): x 1 + x 2 ripetuto per n volte = stabile 2 2 http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/sites/entrez? cmd=Retrieve&db=Pub. Med&list_uids=3976570&dopt=Abstract LINK 80

Aspetti particolari in ematologia I valori ricavati dopo almeno un mese a bach di 20 sulla propria popolazione vengono graficati su carte di controllo e ci rassicurano della correttezza dei nostri valori. MCV MCHC Go 81

Considerazioni finali Abbiamo visto, seppur incompletamente, quanta competenza è necessaria per garantire la qualità dei dati forniti, ma è ancor più importante la pianificazione e definizione della qualità analitica desiderata e le registrazioni degli interventi programmati che mettiamo in atto per mantenerla. 82

Considerazioni finali. . segue E’ bene ricordare che il controllo di qualità è lo strumento da utilizzare per verificare che il sistema analitico rimanga stabile (entro i limiti definiti), ma non migliora le prestazioni analitiche. In presenza di un sistema con scarsa precisione, il controllo qualità può solo evidenziarla ma non modificarla. Per diminuirla è necessario operare interventi diversi. Il confronto tra le prestazioni effettive del sistema analitico e la qualità necessaria è pertanto un punto essenziale: se non viene fatto non si è in grado di stabilire “quale” qualità viene controllata. 83

Durata minima conservazione documentale Registrazione dei riesami da parte della Direzione 5 ANNI Controlli di qualità esterni (VEQ) 3 ANNI Registrazione dei controlli di Qualità interni 1 ANNO Non conformità riscontrate in accettazione 1 ANNO Registrazione addestramento professionale Durata rapporto Controllo dei risultati metodiche manuali (o liste 6 MESI di lavoro) Registrazione dei reagenti 6 MESI In rosso requisito di legge Copie di referti cartacei 6 MESI 84

Aspetti particolari in microbiologia I controlli di qualità esterni in microbiologia (VEQ) si basano sull’invio di ceppi ATCC, invio di vetrini e/o immagini fotografiche, scambio di ceppi tra laboratori certificati e devono considerarsi obbligatori ai fini certificativi o di accreditamento professionale. N. B. In sierologia e virologia i campioni negativi e positivi inseriti nei kit commerciali sono essenzialmente dei calibratori (! Non sono controlli di qualità). Consentono di verificare semplicemente la validità del saggio (controllo di validità) rispetto ai criteri prestabiliti da parte del produttore. Consentono di monitorare solamente le variazioni e le derive più grossolane delle performance del metodo o dello strumento se cablato (Es. emogasanalizzatori decentrati). 85

Aspetti particolari in microbiologia La matrice spesso non è rappresentativa dei campioni dei Pazienti. Devono essere utilizzati campioni esterni al sistema analitico, che NON SONO I CONTROLLI E I CALIBRATORI DEL KIT È raccomandato 1 campione del giorno prima per seduta analitica, posto all’inizio della serie (day to day QC). Permette di monitorare giorno per giorno le performance del test utilizzato, indipendentemente dai controlli del kit (riproducibilità, variazioni in sensibilità fra lotti diversi, errori casuali e sistematici). 86

Aspetti particolari in Anatomia patologica e biologia molecolare Premesso che la standardizzazione proceduralizzata delle diverse operatività tecnico analitiche (tagli al microtomo, colorazioni, voltaggi al microscopio elettronico, ecc. ) sono alla base di tutti i processi certificati in qualità, i controlli di qualità in A. P. sono rappresentati, dal confronto di valutazioni individuali scritte, fatte su preparati istologici a cadenza e scelta programmata RANDOM ( Es. terzo caso del primo lunedì del mese, ecc. ). E’ da evitare il confronto esclusivamente su casi difficili e selezionati. I controlli di qualità esterni si avvalgono dell’invio di vetrini, immagini e filmati con il confronto tra più laboratori. 87

I controlli di qualità in biologia m. Anche in questo caso i controlli negativo e positivo dovranno intendersi come calibratori. 5664 -5 67 9 88

Come trasformare un controllo di calibrazione in un controllo qualità. Nella slide precedente abbiamo visto i due range per le temperature: Tm 1: 56 -59 Tm 2: 64 -67. Se i nostri standard interni ricadono in questo range= tutto ok. Se riportiamo i valori in un carta di Lewey Jennings = controllo di qualità. 89

Cerutti Gino Il campione è neg. (omozigote) : 1 solo picco nel range previsto e con i Cal nei range e con i picchi previsti Range 62 -68 90

FLOW CHART Simbologia ISO (international standard organization) 92

FLOW CHART Esempio in simbologia ISO 93

FLOW CHART Simbologia ASME (american society mechanical engeneering) 94

GRAZIE PER L’ATTENZIONE 95