UNIVERSIT DEGLI STUDI G DANNUNZIO CHIETI Facolt di

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI “G. D’ANNUNZIO”. CHIETI Facoltà di Medicina e Chirurgia Scuola di Specializzazione

Villi coriali (CVS) I tessuti placentari possono mostrare aberrazioni CVS cromosomiche non specificatamente fetali,

Scopo n Presentare una casistica di 10. 000 analisi cromosomiche consecutive su campioni di

Materiali e metodi (1) Età materna Familiarità per anomalie cromosomiche Indicazioni per l’indagine citogenetica

Materiali e metodi (2) Analisi cromosomica su villi coriali Metodo semidiretto Bandeggi: • QFQ

Materiali e metodi (3) Analisi cromosomiche su colture di liquido amniotico Analisi di verifica

Risultati. Tab 1. 10000 CVS. Analisi del trofoblasto e mesoderma. Aberrazioni numeriche autosomiche. (1)

Risultati. Tab 1. 10000 CVS. Analisi del trofoblasto e mesoderma. Aberrazioni numeriche autosomiche. (2)

Risultati. Tab 2. 10000 CVS. Analisi del trofoblasto e mesoderma. Aberrazioni gonosomiche. citotrofoblasto casi

Risultati. Tab 3. 10000 CVS. Analisi del trofoblasto e mesoderma. Riarrangiamenti strutturali. formula cromosomica

Risultati (Tab. 1) Trisomia 21 formula trofoblasto casi mesoderma liquido amniotico (LA) 47 +21

Risultati (Tab. 1) Trisomia 18 formula trofoblasto casi 47 +18 46 XX mesoderma liquido

Risultati (Tab. 1) Trisomia 13 formula trofoblasto casi mesoderma liquido amniotico (LA) 47 +13

Risultati (Tab. 1) Altre trisomie omogenee formula trofoblasto casi mesoderma liquido amniotico (LA) follow

Risultati (Tab. 1) Altre trisomie a mosaico formula trofoblasto casi mesoderma 46/47 46/47 +3

Risultati (Tab. 2) Aberrazioni gonosomiche citotrofoblasto casi coltura mesoderma follow up 45, X /46,

Risultati (Tab. 3) Traslocazioni reciproche apparentemente bilanciate formula cromosomica (trofoblasto e coltura) 46, XX

Risultati (Tab. 3) Aberrazioni cromosomiche strutturali sbilanciate formula cromosomica (trofoblasto e coltura) familiarità controllo

Risultati (Tab. 3) Traslocazioni robertsoniane formula cromosomica (trofoblasto e coltura) familiarità controllo citogenetica su

Discussione Trisomie autosomiche omogenee n Le trisomie 21 e 18 omogenee senza discrepanze tra

Discussione Trisomie autosomiche omogenee n Le trisomie 10 e 15 in un caso su

Discussione Trisomie autosomiche a mosaico n Trisomia 21 a mosaico: q q q n

Discussione Cromosomi marcatori (ESAC) n Marcatori sovranumerari omogenei: q n 3 casi de novo

Discussione Anomalie gonosomiche dei cromosomi n Corredi a 47 cromosomi: q n Monosomia X:

Discussione Riarrangiamenti strutturali n Traslocazione reciproca bilanciata: q n 3 casi de novo hanno

Fig. 1. Metafase 46, XX (QFQ) da preparato semidiretto di trofoblasto. I cromosomi 5

Fig. 2. Metafase 46, XX (QFQ) da preparato colture di mesoderma. I cromosomi 5

Discussione Riarrangiamenti strutturali n Traslocazioni robertsoniane: q q 9 casi familiari con t(13; 14),

Conclusioni n Questa casistica decennale di 10000 casi mette in luce il principale problema

Conclusioni n Le aberrazioni numeriche autosomiche trovate sui villi coriali di questa serie mostrano

Conclusioni n Fra le aberrazioni numeriche a mosaico sul trofoblasto solo la trisomia 21

Conclusioni n Gran parte delle trisomie autosomiche meno frequenti e gran parte dei mosaicismi

Conclusioni n Nella coscienza delle problematiche biologiche insite nell’uso diagnostico di un tessuto annesso

Un grazie particolare al Dr. Lamberto Camurri ed ai colleghi del laboratorio HI-TECH di

Slides: 63

Download presentation

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI “G. D’ANNUNZIO”. CHIETI Facoltà di Medicina e Chirurgia Scuola di Specializzazione in Genetica Medica Direttore Prof G. Palka Analisi cromosomica su villi coriali: diecimila casi. Affidabilità e problematiche della diagnosi cromosomica prenatale nel primo trimestre di gravidanza Relatore: Chiar. mo Prof. G. Palka Tesi di Specializzazione di: D. ssa Monia Rinaldini ANNO ACCADEMICO 2002 - 2003

Villi coriali (CVS) I tessuti placentari possono mostrare aberrazioni CVS cromosomiche non specificatamente fetali, ma citotrofoblasto confinate alla placenta metodo semidiretto mesoderma Le linee guida protocollari della Società dia. Genetica metodo coltura consigliano l’utilizzo sia della metodica semidiretta che colturale nella attività tessuti placentari diagnostica

Scopo n Presentare una casistica di 10. 000 analisi cromosomiche consecutive su campioni di villi coriali (CVS) eseguite con entrambi i metodi. n Evidenziare affidabilità e problematiche della diagnosi cromosomica prenatale mediante prelievo di villi coriali nel primo trimestre di gravidanza.

Materiali e metodi (1) Età materna Familiarità per anomalie cromosomiche Indicazioni per l’indagine citogenetica Marcatori sierici ad aumentato rischio Segni ecografici alterati Genitori portatori di anomalie cromosomiche

Materiali e metodi (2) Analisi cromosomica su villi coriali Metodo semidiretto Bandeggi: • QFQ di routine • GTG occasionale • DA-DAPI occasionale Metodo a coltura Metafasi analizzate in totale su entrambi i preparati: • 20 per cariotipo omogeneo • Numero più esteso nei casi di mosaicismo

Materiali e metodi (3) Analisi cromosomiche su colture di liquido amniotico Analisi di verifica e controllo di aberrazioni cromosomiche di dubbia interpretazione Analisi cromosomiche su colture di sangue periferico postnatale Esclusione di Disomia Uniparentale (UPD) Identificazione di piccoli marcatori cromosomici (FISH)

Risultati. Tab 1. 10000 CVS. Analisi del trofoblasto e mesoderma. Aberrazioni numeriche autosomiche. (1) formula trofoblasto casi mesoderma liquido amniotico (LA) follow up 47 +21 70 confermato coltura TAB 47 +18 16 confermato coltura TAB 46 XX 2 47, XX, +18 LA 47 +13 2 conferm coltura mos conferm LA mos post TAB 47 +13 5 confermato coltura 47 +13 1 non conferm coltura non confermato LA 47 +10 1 confermato coltura confermato cute post TAB 47 +10 1 confermato coltura non confermato LA ongoing 47 +15 2 non conferm coltura non confermato LA 1/UPD-/fenotipo normale 47 +15 1 47 +16 1 confermato coltura non confermato LA FU fenotipo normale 47 +16 1 non conferm coltura non confermato LA FU fenotipo normale 47 +20 2 conferm coltura mos non confermato LA FU fenotipo normale 47 +20 1 non conferm coltura 47 +ESAC 1 failed coltura confermato LA (DN) FU fenotipo normale 47 +ESAC 2 confermato coltura confermato LA (DN) FU fenotipo normale markers. US TAB FU fenotipo normale confermato LA post SAB FU fenotipo normale

Risultati. Tab 1. 10000 CVS. Analisi del trofoblasto e mesoderma. Aberrazioni numeriche autosomiche. (2) formula 46/47 trofoblasto +21 casi mesoderma liquido amniotico (LA) follow up 6 non conferm coltura non confermato LA FU fenotipo normale 3 conferm coltura mos conferm LA mos TAB 1 confermato coltura (47, +21) 1 non conferm coltura confermato LA TAB perso al follow up 46 XX 1 46/47, +21 coltura 46/47, +21 LA TAB/segni clinici 46 XY 1 46/47, +21 coltura 46, XY LA FU fenotipo normale 46/47 +18 6 non conferm coltura non confermato LA FU fenotipo normale 46/47 +18 1 conferm coltura confermato LA igroma cistico 46/47 +13 7 non conferm coltura non confermato LA FU fenotipo normale 46/47 +3 2 non conferm coltura FU fenotipo normale 46/47 +8 1 non conferm coltura FU fenotipo normale 46/47 +22 2 non conferm coltura non confermato LA FU fenotipo normale 46/47 +7 1 confermato coltura non confermato LA no UPD; FU normale 46/47 +9 1 failed coltura non confermato LA FU fenotipo normale 46/47 +12 1 non conferm coltura non confermato LA FU fenotipo normale 46/47 +ESAC 1 confermato coltura non confermato LA FU fenotipo normale 1 failed coltura non confermato LA FU fenotipo normale 1 non conferm coltura 46/47, +18 perso al follow up 1 non conferm coltura non confermato LA FU fenotipo normale 1 confermato coltura confermato LA perso al follow up 46/47 ish 18+invdup 15 materno

Risultati. Tab 2. 10000 CVS. Analisi del trofoblasto e mesoderma. Aberrazioni gonosomiche. citotrofoblasto casi coltura mesoderma follow up 45, X /46, XY 5 46, XY maschio normale 45, X /46, XX 2 46, XX LA 46, XX 45, X /46, XX /47, XX, +21 1 (2/27/1) 45, X 1 45, X / 46, XX perso al follow up 45, X 6 45, X 3/6 NT > 4 - TAB 45, X 1 46, X, dic(Y)(q 11. 2) LA 45, X / 46, X, dic(Y)(q 11. 2) 46, XY trofoblasto. FISH 14/300 Y+; TAB LA 46, XX 45, X 1 47, XXY 2 confermato 47, XYY 3 confermato 47, XXX 1 confermato

Risultati. Tab 3. 10000 CVS. Analisi del trofoblasto e mesoderma. Riarrangiamenti strutturali. formula cromosomica (trofoblasto e coltura) familiarità controllo citogenetica su LA o tessuto follow up 46, XX t (13; 19) (p 11; p 11) dn confermato fenotipo normale 46, XX t (1; 18) (p 32; q 11. 2) dn confermato fenotipo normale 46, XX t (4; 10) (q 33; q 22) dn confermato fenotipo normale 46, XX/46, XX -11 + der (11) t (11 p; ? ) dn confermato malformazioni TAB 20 w 46, XY - 18 + der (18) t (3; 18) pat confermato malformazioni TAB 14 w 46, XY/46, XY - 15 + der (15) t (15 p; ? ) dn 46, XY fenotipo normale 46, XY - 14 + der (18) t (14; 18) (q 21; q 12) pat confermato malformazioni TAB 20 w 46, XY - 20 + der (20) dup (p 11. 1 p 11. 2) dn confermato no malformaz TAB 11 w 46, XY ring (15 q) dn confermato malformazioni TAB 20 w 46, XX del 5 dn 46, XX fenotipo normale dn 46, XX, del (5)(p 12) SP cri du chat/morte perinatale 20 (p 21. 3; p 11. 3) (p 13) 46, XX 45, XX o XY der (13; 14) (q 10; q 10) mat 6 casi 4/UPD negativa/ fenotipo normale 45, XX o XY der (13; 14) (q 10; q 10) pat 3 casi 1/UPD negativa/fenotipo normale 45, XY ish der (15; 21) (q 10; q 10) dn ishder (15; 22)(q 10; q 10)UPDneg fenotipo normale

Risultati (Tab. 1) Trisomia 21 formula trofoblasto casi mesoderma liquido amniotico (LA) 47 +21 70 confermato coltura 46/47 +21 6 non conferm coltura non confermato LA conferm LA mos 46 XX 3 conferm coltura mos 1 confermato coltura (47, +21) 1 non conferm coltura 1 46/47, +21 coltura 46 XY 1 46/47, +21 coltura follow up TAB confermato LA 46/47, +21 LA 46, XY LA FUfenotipo normale TAB perso al follow up TAB/ segniclinici FU fenotipo normale

Risultati (Tab. 1) Trisomia 18 formula trofoblasto casi 47 +18 46 XX mesoderma liquido amniotico (LA) follow up 16 confermato coltura TAB 2 47, XX, +18 LA markers. US FU fenotipo normale igroma cistico 46/47 +18 6 non conferm coltura non confermato LA 46/47 +18 1 conferm coltura confermato LA Tutti i casi di trisomia 18 a mosaico dimostratisi veri nel feto erano accompagnati da anomalie ecografiche rilevanti, onfalocele e igroma cistico

Risultati (Tab. 1) Trisomia 13 formula trofoblasto casi mesoderma liquido amniotico (LA) 47 +13 2 conferm coltura mos 47 47 +13 5 1 confermato coltura non confermato LA 46/47 +13 7 non conferm coltura non confermato LA follow up conferm LA mos post TAB FU fenotipo normale

Risultati (Tab. 1) Altre trisomie omogenee formula trofoblasto casi mesoderma liquido amniotico (LA) follow up 47 47 +10 1 1 confermato coltura confermato cute post TAB confermato coltura non confermato LA 47 +15 2 non conferm coltura 47 +15 1 47 47 +16 1 1 confermato coltura non confermato LA FU fenotipo normale 47 47 +20 2 1 conferm coltura mos non conferm coltura non confermato LA FU fenotipo normale 47 47 +ESAC 1 2 failed coltura confermato LA (DN) FU fenotipo normale non confermato LA ongoing 1/UPD-/fenotipo normale confermato LA post SAB

Risultati (Tab. 1) Altre trisomie a mosaico formula trofoblasto casi mesoderma 46/47 46/47 +3 +8 +22 +7 +9 +12 2 1 1 1 non conferm coltura confermato coltura failed coltura non conferm coltura 46/47 +ESAC 1 1 1 confermato coltura failed coltura non conferm coltura confermato coltura 46/47 ish 18+invdup 15 liquido amniotico (LA) follow up non confermato LA FU fenotipo normale no UPD; FU normale FU fenotipo normale non confermato LA 46/47, +18 non confermato LA materno FU fenotipo normale perso al follow up

Risultati (Tab. 2) Aberrazioni gonosomiche citotrofoblasto casi coltura mesoderma follow up 45, X /46, XY 5 46, XY maschio normale 45, X /46, XX 2 46, XX LA 46, XX 45, X /46, XX /47, XX, +21 1 (2/27/1) 45, X 1 45, X / 46, XX perso al follow up 45, X 6 45, X 3/6 NT > 4 - TAB 45, X 1 46, X, dic(Y)(q 11. 2) LA 45, X / 46, X, dic(Y)(q 11. 2) 46, XY trofoblasto. FISH 14/300 Y+; TAB LA 46, XX 45, X 1 47, XXY 2 confermato 47, XYY 3 confermato 47, XXX 1 confermato

Risultati (Tab. 3) Traslocazioni reciproche apparentemente bilanciate formula cromosomica (trofoblasto e coltura) 46, XX t (13; 19) (p 11; p 11) 46, XX t (1; 18) (p 32; q 11. 2) 46, XX t (4; 10) (q 33; q 22) familiarità controllo citogenetica su LA o tessuto follow up dn dn dn confermato fenotipo normale

Risultati (Tab. 3) Aberrazioni cromosomiche strutturali sbilanciate formula cromosomica (trofoblasto e coltura) familiarità controllo citogenetica su LA o tessuto dn confermato malformazioni TAB 20 w 46, XY-18+der(18) t(3; 18)(p 21. 3; p 11. 3)pat confermato malformazioni TAB 14 w 46, XX/46, XX -11+der(11) t(11 p; ? ) follow up 46, XY/46, XY-15+der(15)t(15 p; ? ) dn 46, XY fenotipo normale 46, XY-14+der(18) t(14; 18)(q 21; q 12) pat confermato malformazioni TAB 20 w 46, XY-20+der(20)dup 20(p 11. 1 p 11. 2) dn confermato no malformaz TAB 11 w 46, XYring(15 q) dn confermato malformazioni TAB 20 w 46, XXdel 5(p 13) dn 46, XX fenotipo normale 46, XX dn 46, XX, del (5)(p 12) SP cri du chat/ morte perinatale

Risultati (Tab. 3) Traslocazioni robertsoniane formula cromosomica (trofoblasto e coltura) familiarità controllo citogenetica su LA o tessuto follow up 45, XX o XYder(13; 14)(q 10; q 10) mat 6/confermato 4/UPDnegativa/ fenotipo normale 45, XX o XYder(13; 14)(q 10; q 10) pat 3/confermato 1/UPDnegativa/ fenotipo normale 45, XYishder(15; 21)(q 10; q 10) dn ishder(15; 22)(q 10; q 10) ishder (15; 22) (q 10; q 10)UPDneg fenotipo normale

Risultati (Tab. 3) Traslocazioni robertsoniane formula cromosomica (trofoblasto e coltura) familiarità controllo citogenetica su LA o tessuto follow up 45, XX o XYder(13; 14)(q 10; q 10) mat 6/confermato fenotipo normale 4/UPDnegativa/ 45, XX o XYder(13; 14)(q 10; q 10) pat 3/confermato 1/UPDnegativa/ fenotipo normale 45, XYishder(15; 21)(q 10; q 10) dn ishder(15; 22)(q 10; q 10) ishder (15; 22) (q 10; q 10)UPDneg fenotipo normale

Discussione Trisomie autosomiche omogenee n Le trisomie 21 e 18 omogenee senza discrepanze tra trofoblasto e mesoderma, confrontate con trials internazionali, consentono di non dubitare dell’affidabilità nell’identificazione di queste due comuni trisomie. n In due casi di trisomia 18 il trofoblasto mostrava cariotipo normale, mentre gli altri tessuti (mesoderma e liquido amniotico) mostravano trisomia 18 omogenea. Tali casi presentavano segni ecografici importanti: igroma ed onfalocele. La trisomia 13 ha mostrato un caso, sugli 8 totali, ove il trofoblasto positivo non ha trovato riscontro sugli altri tessuti. n

Discussione Trisomie autosomiche omogenee n Le trisomie 10 e 15 in un caso su due si sono dimostrate rappresentative della condizione fetale sia che fossero viste solo nel trofoblasto e mesoderma. n Le trisomie 16 e 20 non sono mai state confermate nel feto. n Nel campo delle trisomie autosomiche omogenee: q q 8 casi sono falsi positivi nel trofoblasto (talvolta anche nel mesoderma), con la esclusione solo delle trisomie 21 e 18; 2 casi falsi negativi in cui il trofoblasto manca di identificare la trisomia 18 omogenea.

Discussione Trisomie autosomiche a mosaico n Trisomia 21 a mosaico: q q q n Trisomia 18 a mosaico: q q n 4 casi risultano veri mosaicismi; 7 casi risultano falsi positivi, di cui 6 hanno la trisomia confinata al trofoblasto, uno confinata al mesoderma; Un caso falso negativo con trofoblasto a cariotipo normale, mesoderma e liquido amniotico a mosaico. Un caso risulta vero mosaicismo (igroma cistico); 6 casi risultano falsi positivi con trisomia confinata al trofoblasto. Tutti gli altri casi di mosaicismo per aberrazioni numeriche autosomiche trovate nel trofoblasto in varia misura confermate o meno nella coltura di mesoderma, non vennero confermate sul liquido amniotico ed ebbero follow up normale.

Discussione Cromosomi marcatori (ESAC) n Marcatori sovranumerari omogenei: q n 3 casi de novo confermati su liquido amniotico ebbero fenotipo normale alla nascita, ma non furono disponibili per ulteriori studi; Marcatori sovranumerari a mosaico: q q un caso di origine materna; 3 casi non confermati; un caso +invdup(15) confermato; un caso complesso dove un marcatore non derivativo 18 confinato al trofoblasto del villo si associò ad un mosaicismo per trisomia 18 nel liquido amniotico: il caso fu perso al follow up.

Discussione Anomalie gonosomiche dei cromosomi n Corredi a 47 cromosomi: q n Monosomia X: q q q n trisomia X, maschio a disomia X o Y, hanno trovato sempre conferma fetale; 6 casi hanno trovato conferma nel mesoderma; 2 casi hanno mostrato mosaicismo con una linea maschile (cromosoma Y normale o derivativo); un caso ha mostrato mosaicismo con una linea 46, XX. Anomalie gonosomiche a mosaico: q 8 casi di mosaicismo nel trofoblasto non hanno trovato conferma nella coltura di mesoderma;

Discussione Riarrangiamenti strutturali n Traslocazione reciproca bilanciata: q n 3 casi de novo hanno trovato conferma sui tessuti fetali. Riarrangiamenti sbilanciati: q q q 5 casi hanno trovato conferma sui tessuti fetali; un caso di derivativo 15 a mosaico e un caso con delezione parziale del 5 p non sono stati confermati su liquido amniotico con fenotipo normale (falsi positivi); Un caso con cariotipo femminile normale identificato in trofoblasto e coltura ha rivelato alla nascita delezione 5 p 12 su sangueperiferico e sindrome Cri du Chat con morte perinatale (falso negativo). Fig. 1 -2

Fig. 1. Metafase 46, XX (QFQ) da preparato semidiretto di trofoblasto. I cromosomi 5 a confronto con del(5)(p 12) del cariotipo postnatale (GTG)

Fig. 2. Metafase 46, XX (QFQ) da preparato colture di mesoderma. I cromosomi 5 a confronto con del(5)(p 12) del cariotipo postnatale (GTG)

Discussione Riarrangiamenti strutturali n Traslocazioni robertsoniane: q q 9 casi familiari con t(13; 14), negativi alla UPD 14 in 5 casi esaminati, hanno mostrato sempre follow up normale; un caso discordante fra villo coriale, liquido amniotico e sangue neonatale per una traslocazione tra un cromosoma 15 e 21 nel villo, che era 15 e 22 negli altri tessuti ha mostrato fenotipo normale.

Conclusioni n Questa casistica decennale di 10000 casi mette in luce il principale problema biologico per l’affidabilità diagnostica dei villi coriali: il possibile confinamento placentare del cariotipo individuato con l’analisi dei tessuti del trofoblasto e a volte anche del mesoderma. n 4 casi sui 10000 sono risultati normali nel trofoblasto ed un caso anche su coltura, si trattava di: q q q due trisomie 18; un mosaicismo per trisomia 21; una delezione 5 p – Cri du Chat;

Conclusioni n Le aberrazioni numeriche autosomiche trovate sui villi coriali di questa serie mostrano immediata significatività solo per le trisomie comuni 18 e 21, mentre gli altri casi di trisomie omogenee necessitano di ulteriori controlli a prescindere dal dato del mesoderma. La presenza di 2 falsi negativi di trisomia 18 limita l’utilizzo del villo coriale come strumento rapido di verifica di dati ultrasonografici allarmanti

Conclusioni n Fra le aberrazioni numeriche a mosaico sul trofoblasto solo la trisomia 21 sembra meritare attenzione circa la conferma su tessuti diversi e/o fetali, infatti il cariotipo normale su coltura non esclude la presenza di tale aberrazione nel feto. Un caso di falso negativo per la trisomia 21 a mosaico vera, esalta la necessità del cariotipo sul mesoderma come dato integrato alla diagnosi cromosomica sui villi coriali

Conclusioni n Gran parte delle trisomie autosomiche meno frequenti e gran parte dei mosaicismi si sono dimostrate confinate alla placenta, così come i mosaicismi per le anomalie numeriche dei gonosomi. n Anche gli riarrangiamenti strutturali non sfuggono al rischio del confinamento placentare essendosi dimostrati in 2 casi su 10 della nostra serie.

Conclusioni n Nella coscienza delle problematiche biologiche insite nell’uso diagnostico di un tessuto annesso al feto, ma con una storia embrionale indipendente, l’analisi cromosomica sui villi coriali si dimostra strumento efficace e rapido adatto nelle gravidanze a rischio dove la tempestività della conoscenza del cariotipo supporta il managemant della gravidanza stessa. n La attenta e completa applicazione dei protocolli diagnostici deve essere confortata da una completa informazione dei pazienti e dei loro consulenti sulle problematiche ed i limiti insiti nell’uso del tessuto dei villi coriali nella diagnosi cromosomica fetale allo scopo di evitare incaute e totalizzanti aspettative.

Un grazie particolare al Dr. Lamberto Camurri ed ai colleghi del laboratorio HI-TECH di Parma, ai genetisti ed ai tecnici dei laboratori ARCELLA e BIOLAB di Padova e a tutti i colleghi Ostetrici che con il loro insostituibile lavoro hanno reso possibile questo studio.