Universit degli Studi di Torino Corso di Laurea

Università degli Studi di Torino Corso di Laurea Specialistica Biotecnologie Mediche Immunologia Molecolare Emoglobinuria Parossistica Notturna 22 novembre 2007 Genuardi Elisa

L’Emoglobinuria Parossistica Notturna (PNH) è una rara patologia acquisita caratterizzata da un’espansione clonale non maligna di una o più cellule staminali ematopoietiche, causata da mutazioni somatiche a livello del gene PIGA sul cromosoma Xp 22 [2]

…Un po’ di Storia… 1866: Sir William Gull descrisse il caso di un giovane paziente con “ematinuria” 1882: Strubin, riconobbe Hb come pigmento delle urine nei casi descritti 1928: Enneking conia il nome di Emoglobinuria Parossistica Notturna 1930: Ham osserva che i globuli rossi nella PNH sono sensibili alla lisi mediata dal complemento 1956: deficit di ACh. E negli eritrociti di pz con PNH 1970 -1990: identificazione delle proteine transmenbrana mancanti nei globuli rossi si pz con PNH con un ruolo nella lisi complemento-mediata 1993: Kinoshita isola il gene PIG A come responsabile delle caratteristiche molecolari dell’EMOGLOBINURIA PAROSSISTICA NOTTURNA

…PIG A e biosintesi delle GPI anchor proteins… http: //www. ncbi. nlm. nih. gov PIG A [5]

…le Conseguenze…. [5]

…CD 55 e CD 59… CD 59 CD 55 http: //asheducationbook. hematologylibrary. org

Azione su C 3 -C 5 convertasi [6] inibisce MAC Azione su C 3 -C 5 convertasi inibisce MAC piastrine Deficit u-PAR INIBIZIONE ATTIVITA’ FIBRINOLITICA e INDOTTA ESPRESSIONE ATTIVITA’ PROTROMBINICA Microvescicolazione complessi MAC e lisi cellule

…Caratteristiche Cliniche… • Emoglobinuria • Trombosi • Anemia • Disfagia • Dolori addominali • Spasmi esofagei • Impotenza maschile http: //www. thecrookstoncollection. com http: //www. hmds. org. uk

…Diagnosi… TEST DI HAM studia la sensibilità delle emazie al complemento in mezzo acido a ph 6. 5 e a 37°C TEST AL SACCAROSIO studia l’anomala sensibilità al complemento delle emazie in un mezzo a debole forza ionica LIMITI Non sensibile No quantificativo Falsi negativi Adattata da Pasquinelli F. ”Diagnostiche e Tecniche di Laboratorio”

CITOFLUORIMETRIA • Permette la quantificazione • Tecnica sensibile (minimo 0, 003% cells GPI -AP-) • Utilizzo di Mo. Ab che riconoscono GPI anchor proteins (anti-CD 55 e anti CD 59) e Moab verso marker specifici delle linee cellulari [8]

FLAER (Fluorescently Labelled Inactive variant of the Protein Aerolysin) [6] • Alta affinità e specificità per “l’ancora” delle GPI-APs • Identifica, in base alla % cloni PNH, pazienti a rischio di trombosi • La % di granulociti è indice di dolori addominali, grado di emolisi, spasmi orofagei e disfunzioni erettili.

[2] …MOSAICISMO CELLULARE SOMATICO…

…MOISACISMO CELLULARE SOMATICO… Osservato con test di sensibilità alla lisi complemento-mediata e confermato con esperimenti di citofluorimetria e FLAER Pazienti con PNH possono presentare 3 popolazioni di GR: PNH I normali, GPI-APs presenti PNH II deficit parziale di GPI-APs PNH III deficit totale La gravità della patologia è molto influenzata dalla percentuale di cellule appartenenti alle 3 popolazioni!! [1]

? ? ? MOSAICISMO CELLULARE SOMATICO? ? Gene PIG A(6 esoni) Esone 1 molto corto, non è tradotto Esone 2 codifica per gran parte del trascritto [1] Xp 22 Proteina di 54 k. D, 484 aa con una sequenza idrofobica di 27 aa nei pressi del C- terminale Modelli in vivo: KO Pig A letale a livello embrionale KO condizionali emolisi intravascolare (conferma aspetti clinici) [9]

Donne e uomini: stessa frequenza di PNH HSC XX XY Inattivazione X Mutazioni somatiche su PIG A PNH

… Le Mutazioni … 1995 Bessler et al analizzano il c. DNA di PIG A in quattro linee cellulari GPI-AP- INSERZIONI E DELEZIONI: • Mutazioni missense (cambio aa) • Mutazioni nonsense (stop codon prematuro) • Mutazioni su siti di splicing (lunghezza m. RNA e stabilità) [10] La perdita del trascritto funzionante è dovuta a exon skipping dell’esone 2 DELEZIONE regione promoter (CAAT motifs), esone 1 e parte dell’introne 1 determina una diminuita ma non assente espressione delle GPI-APs

2005 Hu et al. osservano mutazioni a livello di PIG A anche in cellule di sani Policlonali Avvengono su cellule che non si autorinnovano [11]

Molti studi clinici individuano in pazienti con patologie ematologiche una percentuale di cellule GPI-APs - ANEMIA APLASTICA PNH MIELODISPLASIE P. S: anche i sani hanno mutazioni somatiche in PIG A

Riconosciuto come non self REAZIONE AUTOIMMUNITARIA HSC Antigene self ? ? ? GPI-AP? ? ? ESCAPE ALLA REAZIONE IMMUNITARIA PIG A mut HSC Ma Deficit di GPI-APs EMOLISI e PNH!!!!

… DUE REQUISITI… • Presenza di mutazioni a livello di PIG A • Presenza di un microambiente idoneo, da cui le cellule GPI-APs – possono trarre un vantaggio selettivo alla crescita ( escape alla reazione autoimmunitaria) • Nei pazienti con PNH le mutazioni a carico del gene PIG A sono CLONALI ( colpiscono la stessa regione del gene) Il clone che trae maggior vantaggio alla crescita dal microambiente “autoimmune”, prolifera senza limiti per ripristinare una normale emopoiesi Telomere Restriction Fragments di pz con PNH è molto più corto rispetto ai sani evidenza di una spiccata proliferazione A livello periferico si riflette la mancanza delle GPI-APs IL CLONE PNH NON È UNO STATO PRELEUCEMICO!!!

La PNH è una rara patologia acquisita caratterizzata da un’espansione clonale non maligna di una o più cellule staminali ematopoietiche Classical PNH associata a bone marrow failure Subclinical PNH (nessun segno clinico di emolisi) … un po’ di dati… • Sono affetti da PNH 8000 -10000 persone nel Nord America e Europa Occidentale • Età di insorgenza: 30 -40 anni (10% dei casi insorge a 21 anni o meno) • 50% dei pz muore per trombosi, infezioni (America – Europa occidentale) o neoplasie ematologiche (Asia e paesi Orientali) • Sopravvivenza stimata 10 anni • Terapia mirata ad ogni singola caratteristica clinica

…TERAPIA… CORTICOSTEROIDI emolisi cronica ANDROGENI in possibile combinazione con STEROIDI inibizione del complemento SOMMINISTRAZIONE FERRO e FOLATI/TRASFUSIONI anemia (attenzione alle patologie da sovraccarico di ferro e incompatibilità sistema ABO) WARFARINA trombosi Ma il futuro è…. ECULIZUMAB (against complement C 5)

…References… 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Parker C. J. , ” The pathophysiology of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria”, Experimental Hematology 35, 523(2007) Luzzatto L. , ” Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: an acquired genetic disease with somatic-cell mosaicism”, Current Opinion in Genetics & Development 16, 317(2006) Boccuni P. et al, “Glycosyl phosphatidylinositol (GPI)-anchored molecules and the pathogenesis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria”, Critical Reviews in Oncology: Hematology 33, 25 (2000) Dacie J. V. , Lewis S. M. , ”Paroxymal Nocturnal Haemoglobinuria: clinical manifestations, haematology, and nature of disease”, Ser. Haemat vol V, 3 (1972) Meletis J. , Terpos E. , ”Recent insights into the pathophysiology of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria”, Med Sci Monit, 9(7), 161 (2003) Savage W. , Bodsky R. A. , “New insight into paroxymal nocturnal haemoglobinuria”, Haematology, 12(5), 371(2007) Moyo V. M. et al, ” Natural history of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria using modern diagnostic assays”, British Journal of Haematology, 126, 133 (2004) Richards S. J. et al, Recent advances in the diagnosis, monitoring, and management of patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria”, Cytometry Part B (Clinical Cytometry), 72 B, 291(2007) Rosse W. F. , Ware R. E. , “The molecular basis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria”, Blood, No 9, Vol 86, 3277(1995) Bessler M. et al, “Paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH) is caused by somatic mutations in the PIG-A gene”, The EMBO Journal, vol. 13, 110(1994) Hu R. et al, “PIG-A mutations in normal hematopoiesis”, Blood, n° 10, vol 105, 3848(2005)

11. Johnson R. J. , Hillmen P. , ” Paroxymal nocturnal haemoglobinuria: nature’gene therapy”, J Clin Pathol: Mol Pathol, 55, 145 (2002) 12. Parker C. et al, “Diagnosis and management of paroxymal nocturnal haemoglobinuria”, Blood, n° 12, volume 106, 3699 (2005) 13. Karadimitris A. et al, ” Severe telomere shortening in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria affects both GPI and GPI hematopoiesis”, Blood, n° 13, volume 102, 514 (2003) 14. Parker J. et al, “Eculizumab”, Nature Review-Drug Discovery, 6, 515 (2007)