Universit degli Studi di Firenze SOD Malattie del

Università degli Studi di Firenze SOD Malattie del Metabolismo Minerale e Osseo - Laboratorio di Biologia Cellulare, Direttore Prof. M. L. Brandi X CONGRESSO ORTOMED SOCIETA’ ITALIANA DI ORTOPEDIA E MEDICINA Firenze, 10 -12 Dicembre 2015 La Diagnosi di Ipersensibilità ai Biomateriali Dr. ssa Anna Maria Carossino

… gli ioni metallici possono attivare il sistema immunitario … dimostrata una possibile relazione fra presenza di detriti da usura e fenomeni allergici meccanismo di attivazione non ancora del tutto compreso … non dimostrata una relazione diretta fra entità dell’usura e risposta immunitaria LA RISPOSTA IMMUNITARIA VARIA IN RELAZIONE ALLA SITUAZIONE DI IMMUNOMODULAZIONE DELL’INDIVIDUO

Risposta Fisiologica al Danno Tissutale danno tessutale reazione infiammatoria processo di riparazione richiamo di elementi cellulari processi di differenziazione e proliferazione ripristino dell’integrità tessutale

Risposta Biologica all’ impianto fenomeni di corrosione elettrochimica (contatto con i fluidi corporei) fenomeni di corrosione da usura rilascio di microparticelle o ioni metallici fenomeni di infiammazione reazioni di tossicità locali o sistemiche

Concentrazioni dei frammenti tolleranza dell' impianto modeste quantità di detriti corretta riparazione processo infiammatorio persistente elevate quantità di detriti interruzione meccanismi di riparazione attivazione dei linfociti produzione di citochine infiammatorie produzione di citochine osteolitiche alterazione della risposta immunitaria

. . . il metallo da solo non è un antigene. . . Particella coperta da proteine del siero . . è in grado di adsorbire superficialmente proteine del siero (immunoglobuline, frammenti di complemento attivato). Questi “complessi metallo-proteina” agiscono come antigeni mediano la fase di adesione e di attivazione dei macrofagi

… finalità della fagocitosi. . . Vacuolo di fagocitosi degradazione enzimatica Particella coperta da proteine del siero - formazione di sub unità Recettori degli anticorpi - eliminazione / riutilizzazione DETRITI METALLICI ? ? ? Produzione enzimatica amplificata Necrosi cellulare osteolisi

Reattività ai metalli - reazione di ipersensibilità ritardata (di tipo IV) - si verifica a distanza di 24 -72 ore dal contatto con l'antigene - mediata da linfociti T sensibilizzati (Th 1, Th 2, T citotossici) Riconoscimento dell’antigene Produzione di citochine Richiamo di macrofagi Produzione di altre citochine

. . . . l’ attivazione dei linfociti determina: sintesi di nuove proteine citochine e loro recettori proliferazione cellulare differenziazione declino della risposta immunitaria crescita e differenziazione funzionale dei linfociti T incremento numerico “espsnsione clonale” cellule effettrici eliminazione dell’antigene cellule memoria funzionalmente quiescenti ritorno all’omeostasi

Sviluppo di un metodo per la valutazione della sensibilità ai metalli dosaggio delle citochine sintesi di nuove proteine incorporazione di timidina triziata proliferazione cellulare analisi morfologica differenziazione

Diagnosi di Allergia: pazienti potenzialmente allergici pazienti con protesi dolorosa (dopo esclusione protesi infetta) Reazioni allergiche riferite Reazioni cutanee Anamnesi positiva per allergia a metalli Limitazioni funzionali Anamnesi positiva per allergia a metalli e/o componenti protesi dentarie Anamnesi completa (familiare, personale, patologica) + Esame obiettivo Mobilizzazione asettica + Indagini strumentali + Indagini di laboratorio

QUESTIONARIO PROTOCOLLO “ALLERGIE” - Consenso Prelievo

Data: . . . Motivo del ricovero /visita. . . . . . . . . . . . . . Nome: . . . . Data di nascita : . . . . Indirizzo: . . . . . . . Telefono: . . . Cellulare. . . . Titolo di studio. . . . . Professione . . . Peso . . . . Altezza . . . . Nome e indirizzo del Suo medico curante: . . . . . Attività fisica SI NO Che tipo? . . . . . . . . Tipologia di lavoro Lavora: Prevalentemente in piedi Modesto impegno fisico Pesante impegno fisico Sedentario Dinamico

Le è stata diagnosticata qualche malattia? SI NO Quale? Quanto tempo fa? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E’ stata sottoposta ad altri interventi chirurgici? SI NO Quali? Quanto tempo fa? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ha fatto trasfusioni di sangue? SI NO Quanto tempo fa? . . . . . . . . Ha fatto la vaccinazione antiinfluenzale? SI NO Quanto tempo fa? . . . . . . .

Fa uso frequente di antinfiammatori e/o antidolorifici? SI NO Assume regolarmente altri farmaci? NO SI Quali? Da quanto tempo? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Nella sua famiglia qualcuno soffre o ha sofferto delle seguenti malattie? ( genitori, figli, fratelli, nonni, zii) SI NO Persona: Malattia Allergie: . . . . . . . Malattie autoimmunitarie: . . . . . . Malattie della pelle: . . . . . . Diabete: . . . . . . .

Sa di essere allergico a qualcuno dei prodotti sottoelencati ? Nichel: . . . . . . . Oro: . . . . . . . Argento: . . . . . . . Altri metalli non preziosi: . . . . . Altri materiali: . . . . . . Ha mai eseguito un patch test? SI NO Clinica: . . . . . . . . Risultato del test: . . . . . . . Ha notato cambiamenti del suo stato di salute dopo tale test? SI NO Se si, quali sintomi? . . . . . . .

E’ allergico a penicillina o ad altre medicine? SI NO Se si, a quali? . . . . . . . . Ha mai ricevuto Gammaglobuline o altri vaccini come profilassi o trattamento? SI NO Se si, quali? . . . . . . . Prende vitamine, minerali e/o integratori alimentari? SI NO Quali? . . . . . . . . Ha qualche allergia alimentare? SI NO Che alimento/i? . . . . : . . . . . . Con quali sintomi? . . . . : . . . . . . Da quanto tempo? . . . . . . . Ha altri tipi di allergie? SI NO Quali? . . . . . . . .

Ha protesi articolari o chiodi chirurgici? SI NO Quali? Da quanto tempo? . . . . . . . . . . . . . . . Ha protesi dentarie o impianti? SI NO Quali? Da quanto tempo? . . . . . . . . . . . . . . . Al momento sta effettuando trattamenti dentali? SI NO Se si, da quando? . . . . . . . Ha otturazioni dentali? SI NO Quante? . . . . . . . . Da quanto tempo: Meno di un anno. . Da 1 a 3 anni. . Da 3 a 6 anni. . Più di 6 anni Materiale: Amalgama. . . . . Oro . . Plastiche . . Ceramica . . Altro . . Non so . . Ha notato la comparsa di sintomi che potrebbero essere collegati alla presenza di otturazioni? Se si, quali sintomi? . . . . . . Per quanto tempo sono durati? . . . . . Ha gengive infiammate e/o sanguinanti? SI NO Se si, da quando? . . . . . .

Usa o ha mai usato lenti a contatto? SI NO Quali soluzioni per lenti ha usato? . . . . . Usa o ha mai usato gocce per gli occhi? SI NO Ha allergie a cosmetici? SI NO Se si, quali. . . . . . . . Usa tinture per capelli? SI NO Con che frequenza e da quanto tempo? . . . . . Ha tatuaggi? SI NO Se si, quanti e quando li ha fatti? . . . . . Porta orecchini? Ne ha mai portati in passato? Se si, e’ mai stato disturbato da essi? SI SI SI NO Ha irritazioni della pelle per il contatto con bottoni di jeans, orologi da polso, anelli, gioielli o altri materiali? SI NO . . . . . . . . .

E’ stato esposto a metalli nel luogo di lavoro? SI NO Se si, a quali metalli? . . . . . . Occupazione/i al presente e in passato . . . . . Fuma? SI NO Se si, quanto? . . . . . . . Da quando? . . . . . . . . Ha mai fumato in passato? SI NO Quanto? . . . . . . . . Per quanto tempo? . . . . . . . Altre informazioni: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Consenso al prelievo ed al trattamento dei dati personali: Gentile Sig, r/Sign. ra, il nostro gruppo di ricerca ha avviato un Protocollo di Studio sulla “Reattività Immunitaria alle Componenti protesiche”, al fine di valutare specifiche sensibilità individuali che potrebbero portare alla comparsa di complicanze conseguenti all’intervento. A seguito dell’impianto di protesi, l’organismo reagisce sviluppando una caratteristica risposta infiammatoria, seguita da un processo di riparazione, che porta al progressivo recupero della funzionalità dell’articolazione. Nei primi 3 -12 mesi successivi all’intervento, la protesi si adatta al nuovo ambiente attraverso fasi successive di assestamento biologico e meccanico. L’impianto di protesi può essere accompagnato da complicazioni di carattere generale o locale: in caso di allergie o di ipersensibilità (per esempio alle leghe metalliche, al cemento osseo, a farmaci o disinfettanti) possono manifestarsi effetti transitori (gonfiori, prurito, eruzioni cutanee) e/o altre reazioni di lieve entità. Molto raramente un’ipersensibilità individuale può causare una risposta patologica, precoce o tardiva, che può rendere necessario un intervento di revisione dell’impianto. Scopo della ricerca è valutare lo stato immunitario “basale” del paziente in relazione ad alcuni fattori di rischio generici (età, fattori genetici ereditari, abitudine al fumo, condizioni di soprappeso, malattie concomitanti, ecc. ) ed identificare possibili alterazioni della risposta immunitaria che permettano di riconoscere precocemente eventuali complicazioni conseguenti all’impianto. ………….

…… Per questo si richiede: - compilazione del questionario - esecuzione di un Patch Test -prelievo di sangue, su cui verrà eseguito un test di stimolazione linfocitaria Il test ha carattere sperimentale: si basa su indicazioni derivanti da dati pubblicati sulla letteratura internazionale e fornisce risultati informativi sulla sensibilità linfocitaria ai metalli. Poiché non è riconosciuto come test clinico standardizzato e non è stato validato per scopi diagnostici, i risultati verranno comunicati al medico prescrittore, che provvederà alla loro valutazione. Queste informazioni verranno trattate con estrema riservatezza. La raccolta ed il trattamento dei dati si svolge nel rispetto delle norme sulla privacy. Le informazioni da lei fornite verranno utilizzate esclusivamente per finalità scientifiche. I dati raccolti non saranno ceduti ad altre società o persone. Firma . . . . Da riconsegnare a: Dott. ssa Anna Maria Carossino Laboratorio di Biologia Cellulare SOD Malattie del Metabolismo Minerale ed Osseo Direttore Prof. Maria Luisa Brandi GRAZIE PER LA SUA COLLABORAZIONE

Test Clinici ed Esami di Laboratorio: Test in vivo Patch Test (PT): specifico per diagnosi di dermatiti da contatto Vantaggi: Limiti: - semplicità di esecuzione - valore diagnostico controverso: - rapidità dei tempi di risposta - costi contenuti non tutte le reazioni immunologiche implicano una reazione epicutanea - può indurre sensibilizzazione

Test Clinici ed Esami di Laboratorio: Test in vitro: basati sulla valutazione dell’attivazione linfocitaria Lymphocyte Transformation Test (LTT): misura la risposta proliferativa dei linfociti attivati. Vantaggi: Limiti: - maggiore specificità - eseguito in Laboratori specializzati - evita il contatto diretto - costi maggiori rispetto al PT con allergeni

Test Clinici ed Esami di Laboratorio: Test in vitro basati sulla valutazione dell’attivazione linfocitaria -Dosaggio di citochine: -quantifica le citochine prodotte dai linfociti attivati Vantaggi: Limiti: - elevata sensibilità di rilevazione - eseguito in Laboratori specializzati - test simultaneo di diverse citochine - difficile interpretazione - volumi ridotti di campioni biologici - costi maggiori rispetto a PT e LTT

Test di Sensibilità ai Metalli – LTT Risultati

X - PHA- controllo positivo: media trattato con PHA (espresso in CPM) - Cr. Cl 3 1 m. M: SI 2, 56 volte maggiore rispetto al valore di base - Ni. Cl 2 0, 1 m. M: SI 6, 97 volte maggiore rispetto al valore di base - Ni. Cl 2 0, 01 m. M: SI 6, 12 volte maggiore rispetto al valore di base - Ni. Cl 2 0, 001 m. M: SI 2, 61 volte maggiore rispetto al valore di base - Co 0, 01 m. M: SI 4, 99 volte maggiore rispetto al valore di base - Co 0, 001 m. M: SI 3, 86 volte maggiore rispetto al valore di base -Ti 1 m. M: SI 2, 09 volte maggiore rispetto al valore di base Indice di Stimolazione (SI): trattato/controllo Interpretazione dei risultati: Bassa reattività = 2 -4 volte valore base Media reattività = 5 -10 volte valore base Elevata reattività = > 10 volte valore base

Dosaggio delle Citochine: Luminex Lab. MAP (Laboratory Multi Analyte Profiling Sistema integrato per analisi quantitative Sfrutta il principio della citofluorimetria a flusso e la tecnologia Lab. MAP (fino a 100 saggi per singolo pozzetto di una micropiastra ) Vantaggi: - elevata specificità doppio laser - elevata sensibilità di rilevazione l'alta capacità legante delle microsfere - volumi molto ridotti (circa 10 ul) piccole quantità di campioni biologici - il saggio può essere eseguito su supernatanti di culture cellulari e tessutali, plasma, siero, e su vari fluidi biologici

Dosaggio delle citochine

Microscopia Confocale a Scansione Laser Il microscopio confocale a scansione laser permette di produrre sezioni ottiche dello spessore di 0. 5 nm e di acquisirle direttamente. Tramite l’analisi di immagine computerizzata è possibile ottenere una rappresentazione tridimensionale delle cellule. I dati acquisiti possono poi essere analizzati per determinare il volume, l'area e la morfologia del preparato.

Osservazione col metodo “Z-stack”: consiste nell’acquisire una serie di immagini del campione lungo l’asse z. … è possibile ottenere una rappresentazione tridimensionale delle cellule e misurare, lungo i tre assi, le distanze e le dimensioni dei componenti cellulari, e di eventuali frammenti metallici presenti nella cellula. ROSSO = ACTINA ; BLU = NUCLEI

Microscopia Confocale a Scansione Laser sintomi di sofferenza cellulare: citoscheletro disorganizzato nuclei periferici e picnotici (addensamento e riduzione della cromatina) sintomi di sofferenza cellulare: rigonfiamento cellulare, vacuoli di fagocitosi (frecce gialle)

Diagnosi Preoperatoria in pazienti con protesi dolorosa (dopo esclusione protesi infetta) Diagnosi Preoperatoria in pazienti potenzialmente allergici Anamnesi completa (familiare, personale, patologica) + Esame obiettivo Indagini strumentali Reazioni cutanee Anamnesi positiva per allergia a metalli - Patch Test serie standard metalli - LTT + Anamnesi positiva per allergia a metalli e componenti protesi dentarie - Patch Test: -serie standard metalli -componenti protesi dentarie - LTT + Limitazioni funzionali Indagini di laboratorio Mobilizzazione asettica Sospetta allergia a metalli - Patch Test serie standard metalli componenti cemento osseo - LTT Test citochine Analisi istologica/ immunoistologica del tessuto periprotesico

In conclusione: Non esiste alcun test validato per la determinazione clinica di ipersensibilità ai metalli. Quando, a seguito del percorso indicato si sospetta una allergia a biomateriali, l’utilizzo combinato di patch test, LTT e dosaggio di citochine, può rappresentare un miglioramento nella diagnosi, che permetta: - di individuare il paziente allergico in fase pre-operatoria, - di formulare la diagnosi di allergia nei pazienti protesizzati personalizzare gli interventi sulla base delle diverse esigenze

Grazie per l’attenzione!