Universit de Lige Centre dIngnierie des Protines Recherche
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Université de Liège Centre d’Ingénierie des Protéines Recherche de nouveaux métabolites secondaires chez les Streptomyces La Condromycine: Histoire d’un antibiotique mort-né … Matthias Craig
Introduction Streptomycètes Bactéries Gram + filamenteuses colonisant les sols
Introduction Streptomycètes Producteurs de 2/3 métabolites secondaires utilisés en médecine et dans l’industrie agroalimentaire
Introduction Streptomycètes Séquençage des génomes de S. coelicolor et S. avermitilis révèlent la présence de nombreux clusters « cryptiques » .
Introduction Les bactéries pathogènes multirésistantes aux antibiotiques posent un grave problème médical. recherche de nouvelles molécules. Le groupe Strepto a décidé de rejoindre l’ensemble du CIP dans cette aventure.
Quels sont les signaux environnementaux perçus déclenchant le passage du métabolisme primaire au métabolisme secondaire ?
Criblage de la collection de Streptomyces du CIP pour la recherche de nouveaux antibiotiques Souche S. sp. G 2 Streptomyces sp G 2 produit un métabolite secondaire inhibant la croissance de bactéries Gram -positives (MRSA). Spectre de masse: 1079 Da et présence d’un atome de bore
Il existe trois antibiotiques naturels caractérisés contenant un atome de bore * Le tartrolon: - Produit par Sorangium cellulosum Mw = 888 Da * L’aplasmomycine: - Produite par Streptomyces griseus Mw = 799 Da * La boromycine: - Produite par Streptomyces antibioticus Mw = 866 Da
Objectifs du doctorat • Caractérisation génétique, biochimique et morphologique de la souche G 2. • Détermination des propriétés physico-chimiques de l’antibiotique. • Optimisation de la production de l’antibiotique dans le but de la détermination de sa structure tridimensionnelle par RMN (en collaboration avec le Professeur Luxen, ULg). • Recherche de la cible de l’antibiotique. • Identification des gènes responsables de la biosynthèse de la condromycine (clonage et séquençage du cluster de gènes).
Résultats • 1) Génotypage de Streptomyces sp G 2 en amplifiant, clonant et séquencant le gène codant pour les RNA 16 S et les Internally transcribed spacers (ITS).
Mise au point des conditions optimales de croissance de S. sp. G 2 et de production de condromycine en milieu liquide. 16 h 22 h 40 h 46 h 112 h TSB + glycérol 1% MM + glucose 1% MM + chitine 1% MM + mannitol 1% MM + Glc. NAc 1% TSB + glycérol 1% + chitine 0, 5%
Mise au point des conditions optimales de croissance de S. sp. G 2 et de production de condromycine sur milieu gélosé. MM + glycérol 1% MM + chitine 1% MM + R 2 YE MM + mannitol 1%
Mise au point d’un protocole de production et de purification de condromycine. La souche S. sp. G 2 ne produit plus l’antibiotique en milieu liquide. Mutagenèse chimique au NTG Substitution: GC AT
Screening des colonies après incubation des spores avec du NTG et caractérisation des mutants potentiels NP II NPIV NP VIII S. sp. G 2 SP IV • 15 mutants potentiellement surproducteurs SP VIII SP XII témoin • 21 mutants potentiellement non producteurs • 3 mutants présentant un phénotype fortement altéré Non producteur S. sp. G 2 9 mutants surproducteurs confirmés Surproducteur Mutant brun
4 cultures de 250 ml en TSB + glycérol 1% + chitine 1% Purification: - Extraction liquide-liquide - Purification trois pics sur colonne semipréparative. 35 mg pics A, B et C
Activité biologique Enterococcus faecium Enterococcus faecalis hirae ATCC 9790 Enterococcus hirae EHR Enterococcus hirae R 40 Enterococcus hirae SRI Escherichia coli JM 109
Propriétés physico-chimiques 5795, 6 • Spectres UV: 1267, 9 control • Spectre de masse. 1282, 1 traitement • Stabilité thermique et 597, 4 résistance aux protéases. 90°C 1 h 30 Pronase 4 μg/m. L 24 h 37°C
Production et purification de la condromycine sur milieu gélosé. 100 boîtes de milieu R 2 YE (2, 5 litres) spores du mutant surproducteur SPXII. Condromycine extraite du milieu gélosé en présence d’acétate d’éthyle. Purification par HPLC (colonne C 18) et séparation des trois pics. 150 mg
Spectre de masse des pics A, B et C
… Et c’est l’embardée … • Pic A: 1254, 7 Actinomycin D : 1255, 4 • Pic B: 1268, 8 Actinomycin C 2 : 1269, 4 • Pic C: 1282, 8 Actinomycin C 3 : 1283, 5 Condromycine = Actinomycine? - Masses très proches Spectre d’absorption similaire Même activité (actif contre les gram +) Même spectre RMN du proton spectre 1 H obtenu de fraction B Litt. : Spectre 1 H de actinomycin D
CONDROMYCINE ACTINOMYCINE
Objectifs • Caractérisation génétique, biochimique et morphologique de la souche G 2. S. sp. G 2 = Sous-espèce de S. griseus • Détermination des propriétés physico-chimiques de l’antibiotique. • Optimisation de la. UV, production de l’antibiotique dans le du butp. H, de la Masse, spectre stabilité thermique, stabilité en fonction détermination de sa structure tridimensionnelle par RMN (en hydrophobicité, … collaboration avec le Professeur Luxen, ULg). • Recherche de la cible de l’antibiotique. Se lie à l’ADN empêchant la transcription en ARN • Identification des gènes responsables de la biosynthèse de la hautement toxique. condromycine (clonage et séquençage du cluster de gènes).
Recherche de nouveaux métabolites secondaires 1) Criblage de la collection de Streptomycètes du CIP. Génotypage des souches non identifiées
Recherche de nouveaux métabolites secondaires 1) Criblage de la collection de Streptomycètes du CIP. 2) Méthodologie « das. R » Facteur de transcription pléiotropique. - Métabolisme de la Glc. NAc. Scan du génome de S. coelicolor pour identifier les sites dre (das. Rresponsive element). Act. II-4 et red. Z.
Recherche de nouveaux métabolites secondaires 2) Méthodologie « das. R » DNA array BAP 29 vs S. coelicolor M 145 Act. II-4 red. Z M 145 BAP 29
Recherche de nouveaux métabolites secondaires 2) Méthodologie « das. R » . DNA array BAP 29 vs S. coelicolor M 145 coelicheline
Recherche de nouveaux métabolites secondaires 2) Méthodologie « das. R » DNA array BAP 29 vs S. coelicolor M 145 Gray spore pigment
Recherche de nouveaux métabolites secondaires 2) Méthodologie « das. R » DNA array BAP 29 vs S. coelicolor M 145 scb. R scb. A Gènes SCO 6273 à SCO 6288 régulés par scb. R et scb. A en amont desquels on retrouve un site dre.
Recherche de nouveaux métabolites secondaires 2) Méthodologie « das. R » DNA array BAP 29 vs S. coelicolor M 145 SCO 6273 SCO 6280 = Kas. O
Recherche de nouveaux métabolites secondaires Et en pratique… 1 MM MM + Glc. NAc 1 = M 145 MM + mannitol 1% 2 = BAP 29 MM + mannitol 1% M 145 3 = M 145 MM + Glc. NAc 1% 4 = BAP 29 MM + Glc. NAc 1% Δdas. R 2 3 4
Recherche de nouveaux métabolites secondaires BAP 29 MM + Glc. NAc 1% Spot noir provenant de la TLC
Recherche de nouveaux métabolites secondaires 1 1 = M 145 LB + glucose 1% 2 = BAP 29 LB + glucose 1% 3 = M 145 LB + chitine 1% 4 = BAP 29 LB + chitine 1% 2 3 4
Recherche de nouveaux métabolites secondaires Jus de culture BAP 29 LB + glucose 1% Pic 1 Pic 2 Spot fluorescent provenant de la TLC
Perspectives Effet de la Glc. NAc sur d’autres Streptomycètes. Streptomyces clavuligerus 1 2 3 4 5 6 1 = MM + mannitol 1% 2 = MM + Glc. NAc 1% 3= MM + glucose 1% 4 = MM + glucose 1% + Glc. NAc 1% 5 = MM + chitine 1% 6 = MM + chitine 1% + Glc. NAc 1%
Perspectives PCR pour identifier les souches de la collection possédant le gène das. R. Inactivation du gène Réveil de métabolites cryptiques? Etudier le métabolome des souches de la collection sur différents milieux en présence de différentes sources de carbone et d’azote. Nouveau(x) métabolite(s) à caractériser…
Merci pour votre attention … Sébastien Rigali et toute l’équipe strepto Bernard Joris Jérôme Paris
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