Universidade Federal do Cear Rede Nordeste de Biotecnologia

Universidade Federal do Ceará Rede Nordeste de Biotecnologia Analise Proteômica MÉTODOS DE REVELAÇÃO EM GÉIS E DETECÇÃO DE IMAGENS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA Erika B. de Menezes Prof. Arlindo de Alencar A. Moura 1

MÉTODOS DE REVELAÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA 2

MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA Ä Propriedades desejáveis Æ Faixa dinâmica de detecção; Æ Sensibilidade; Æ Linearidade; Æ Reprodutibilidade; Æ Compatível com espectro de massa; Æ Baixa toxicidade; Æ Baixo custo. (Lópes, 2007) 3

MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA Ä 1 µg de Proteína Revelação por Coomassie Revelação pela Prata (Lópes, 2007) 4

MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA Ä Revelação por Azul Brilhante de Coomassie Blue Ä Revelação fluorescente (Sondas Moleculares) Ä Sypro Ruby Ä Eletroforese em gel diferencial – DIGE Ä Revelação pela Prata 5

REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE (COOMASSIE BLUE) 6

REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE Ä Azul Brilhante de Coomassie Æ Composto aromático de caráter ácido ÊTingir lã ü “Tintura de Coomassie” Ä 1963 Æ Revelação de proteínas (Fazekas de St. Groth et al. , 1963) 7

REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE Ä CBB-R 250 Æ Aromático sulfatado, não polar c Ácido acético e metanol ÊInterações iônicas ÊInterações secundárias ü Pontes de hidrogênio ü Interação de Van der Waals ü Interações hidrofóbicas (amônia sulfatada) (Fazekas de St. Groth et al. , 1963) 8

REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE Ä Ácido tricloroacético (TCA a 12, 5%) c Alta acidez e propriedade corrosiva (Fazekas de St. Groth et al. , 1963) Ä Coomassie Blue (CBB-R 250) Æ sensibilidade (Merril, 1990) 9

REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE Ä CBB-G 250 (Coomassie Blue colloidal) Æ Dimetilado CCB-R c 20% de metanol c [sulfato de amônio] (Neuhoff et al. , 1988) c Pnt/CCB-G ÊNão penetra na matriz apenas interage com a pnts. (Fazekas de St. Groth et al. , 1963) 10

REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE Ä sensibilidade Æ 10 ng ptn/banda (Brush, 1998) Ä Formação do colóide Æ Prolongou o tempo de coloração Ä Metanol Æ Tempo recomendado foi de pelo menos 24 h (Neuhoff et al. 1985) 11

REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE Ä Sulfato de alumínio (Al 2(SO 4)3) c a ligação do corante as (Kang et al. 2002) proteínas c Sensibilidade A – Coomassie Blue B- Coomassie Coloidal *Sulfato de amônio + etanol C- Prata (Kang et al. 2002) 12

REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE Ä Coloração Azul Æ Sulfona do Coomassie Æ Amina das proteínas (Reisner et al. , 1975) Ä Especificidade Æ Proteínas c Não requer separação prévia das Pnt e Aa. (Fazekas de St. Groth et al. , 1963) (Chrambach et al. , 1963) 13

REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE Ä Vantagens Æ Intensa capacidade de coloração; Æ Elevada solubilidade em géis de poliacrilamida e agarose; Æ Capacidade de distinção entre pnt e Aa. ; Æ Compatível com Espectro de Massa; Æ Estável na forma sólida; Æ Fácil manuseio; Æ Baixo custo. (Fazekas de St. Groth et al. , 1963) 14

REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE Ä Limitações Æ Fraca revelação das bandas; Æ Pouco contraste com o gel levemente corado de azul; Æ Sensibilidade; c 50 a 100 x menos sensível que a prata; Æ Faixa dinâmica de detecção. 15

REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE Ä Coomassie Blue G-250 16

REVELAÇÃO POR AZUL BRILHANTE DE COOMASSIE Ä Coomassie Blue G-250 17

REVELAÇÃO FLUORESCENTE 18

REVELAÇÃO FLUORESCENTES Ä Revelações Sypro – Sondas moleculres Æ Sypro Orange; Æ Sypro Red; 1 D SDS PAGE Æ Sypro Tangerine; Æ Sypro Ruby. 2 D SDS PAGE (Pathon et al. , 2002) 19

REVELAÇÃO FLUORESCENTES Ä Sypro Ruby Æ Coloração baseado em um quelato; Cultura de Fibroblastos (Berggren et al. , 2000) (Pathon et al. , 2002) 20

REVELAÇÃO FLUORESCENTES Ä Sypro Ruby Æ Protocolo simples; Æ Glicoproteínas, lipoproteínas; (Steinberg et al. , 1996) (Berggren et al. , 2000) Æ Compatível com EM; Æ Marcador durante a FIE (Steinberg et al. , 2000) Æ ½ vida longa – não foi alcançado aos 19’ (Berggren et al. , 1999) Æ Mais resistente a foto clareador (Smejkal et al. , 2004) 21

REVELAÇÃO FLUORESCENTES Ä Sypro Ruby Æ Transiluminador UV c 300 nm Æ Scanner a laser c Typhoon 22

REVELAÇÃO POR CORANTE FLUORESCENTES Ä Vantagens Æ Compatível com Espectro de massa (MALDI-TOF MS); Æ Identifica pequenas quantidade de ptn. ; (Lopez, 2000) Æ Limite dinâmico linear Æ variabilidade entre géis; Æ quando comparada com a prata c Permite visualizar + 20% de spots (Patton, 2000) (Patton, 2002) Æ Melhor reprodutibilidade; Æ Reutilização para vários géis. 23

REVELAÇÃO POR CORANTE FLUORESCENTES Ä Limitações Æ Elevado custo; Æ Uso de equipamento sofisticado c Scanner (Typhoon) 24

REVELAÇÃO FLUORESCENTES Ä Eletroforese em gel diferencial – DIGE Æ Disponível em 1997 (Unlu et al. , 1997) 25

REVELAÇÃO FLUORESCENTE 26

REVELAÇÃO FLUORESCENTE Cy 3 controle Cy 5 Tratamento (Unlu et al. , (1997) (Issaq & Veenstra (2008) 27 27

REVELAÇÃO FLUORESCENTE Ä Vantagem Æ Menor tempo de analise; Æ Elimina o problema de reprodutibilidade; Æ Melhor comparação do perfil protéico entre indivíduos; Æ Maior acurácia nas comparações de proteínas de diferentes amostras (95% de confiança) Æ Alta sensibilidade. 28

REVELAÇÃO FLUORESCENTE Ä Limitações Æ Dificuldade de cortar spots para analise posterior; Æ Spots são visíveis por scanner específicos; Æ Elevado custo. 29

REVELAÇÃO PELA PRATA 30

REVELAÇÃO PELA PRATA Ä Laboratórios de histologia Ä Géis de Poliacrilamida – Switzer et al. , 1976 Æ Proteínas (Merryl et al. , 1976) Ä Protocolos utilizados em 2 D Æ Nitrato de Prata Æ Diamino de prata ou prata amoniacal [Ag(NH 3)2] (Haines et al. , 1990) 31

REVELAÇÃO PELA PRATA Ä Depende da redução do íon prata metálica (Ag 0) Æ (Ag + elevado potencial de oxidação) Æ Íons Ag interagem com grupos c ácidos carboxílicos ( Asp e Glu), sulfidrilicos (Cys), e aminas (Lys). Æ Formando a prata metálica (Haines et al. , 1990) Ä 2 Ag(NH 3)2+ + 2 HS-R 2 Ag 0 + 4 NH 3 + R-S-S-R + 2 H+ 32

REVELAÇÃO PELA PRATA Ä Etapas Æ 1º fixação – insolubilização das proteínas no gel e remover componentes de interferência (Glicina, TRIS, SDS); Æ 2º Sensibilização Æ 3º Impregnação pela prata; Æ 4º Revelação c Nitrato de Prata – Formaldeído, Carbonato e tiosulfato (Haines et al. , 1990) 33

REVELAÇÃO PELA PRATA Ä Etapas Æ 4º Revelação c Prata amoniacal – Formaldeído (agente redutor) e ácido cítrico ( íons Ag livre) Æ 5º Lavagens Ä Processo semelhante a revelação fotográfica. 34

REVELAÇÃO PELA PRATA Ä Prata amoniacal Æ + contraste Æ + sensibilidade Æ + demorada Ä Bandas ou spots Æ Marrom ou preta Ä Lipoproteínas Æ Azul Ä Glicoproteínas Æ Vermelho 35

REVELAÇÃO PELA PRATA Ä Vantagens Æ Sensibilidade c 100 x maior que o Coomassie Ä Abordagem proteômica Æ Pureza de uma ptn. Æ Detectar pequena quantidade de ptn. (Switzer et al. , 1979) (Haines et al. , 1990) 36

REVELAÇÃO PELA PRATA Ä Limitações Æ Necessita de muitas etapas (Quadroni e James, 1999) c Reprodutibilidade (~20% na intensidade de spots) Æ Alguns íons de prata pode interferir na identificação da ptn; (Oses-Prieto et al. , 2007) Æ Não apresentar ponto de saturação. 37

MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA Métodos Sensibilidade Características Coomassie Blue R 250 50 -100 ng Compatível EM Baixo custo Coomassie Blue G 250 10 ng Compatível EM Fácil manuseio Prata 1 ng Alta sensibilidade Compatível EM Necessita de instrumento sofisticado para aquisição de imagens Sypro Ruby 38

DETECÇÃO DE IMAGENS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA 39

MÉTODOS DE DETECÇÃO DE IMAGENS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA Ä Detecção das imagens Æ Impossibilidade de se determinar visualmente a intensidade de spots ou bandas individualmente; Æ Interpretação de vários spots na 2 D ser muito laboriosa computador; Æ O grande volume de dados em laboratórios de pesquisa Avaliar, processar e salvar são requeridos; Æ 40

MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA Ä Detecção das imagens Æ Impossibilidade de se determinar visualmente a intensidade de spots ou bandas individualmente; Æ Interpretação de vários spots na 2 D ser muito laboriosa computador; Æ O grande volume de dados em laboratórios de pesquisa Avaliar, processar e salvar são requeridos. ; 41

MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA Ä Detecção das imagens Æ Impossibilidade de se determinar visualmente a intensidade de spots ou bandas individualmente; Æ Interpretação de vários spots na 2 D ser muito laboriosa computador; Æ O grande volume de dados em laboratórios de pesquisa Avaliar, processar e salvar são requeridos; Æ Criação banco de dados. 42

MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA Ä Detecção das imagens Æ Impossibilidade de se determinar visualmente a intensidade de spots ou bandas individualmente; Æ Interpretação de vários spots na 2 D ser muito laboriosa computador; Æ O grande volume de dados em laboratórios de pesquisa Avaliar, processar e salvar são requeridos; Æ Criação banco de dados. 43

MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA Ä Eletroferograma Æ Câmeras acoplada a um computador; Æ Densicitometro; Æ Scanners. 44

MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA Ä Scanner de Mesa Æ Alta performance; Æ Fácil uso – rápido; Æ Boa resolução; Æ Baixo custo. 45

MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA Ä Imagem Scanner III Æ Alta resolução; Æ Densidade Ótica ( 3. 4); Æ Resolução 100 e 600 dpi c Géis - 150 e 300 dpi Æ Revelações c Coomassie Blue c Prata 46

MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA Ä Scanner de Mesa 47

MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA Ä Scanner de tela de fósforo de armazenamento Æ Técnica de autoradiografia c > sensibilidade; c Rapidez; c limite linear dinâmico; c Laser de He. Ne Ê633 nm 48

MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA Ä Scanner fluorescentes 49

MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA Ä Scanner de Múltiplo propósito Æ Detecção fluorescente; Æ Tela de fósforo de armazenamento; Æ Quimiluminescência; Æ ≠ comprimentos de ondas associados a ≠ filtros; Æ Detectores são mais sensíveis 50

MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA Ä Scanner de Múltiplo propósito Æ Laser com ≠ comprimentos de ondas Æ ≠ filtros Westermeier, 2005 51

MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA Ä Scanner de Múltiplo propósito Æ Typhoon 9410 52

MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA Ä Scanner de Múltiplo propósito Æ Image. Quant LAS 4000 53

MÉTODOS DE REVELÇÃO EM GÉIS NA ABORDAGEM PROTEÔMICA Característica Scanners Máquina digital Sensibilidade Alta * Resolução Definido pelo software que está lendo Definido pelo tamanho da amostra e pixel da máquina Analise quantitativa A intensidade de luz abrange toda superfície Necessita de correções Plano escuro e superfície plana * Mecanismo de resfriamento 54

Obrigada pela atenção. . . erikavetmest@yahoo. com. br 55