Una Visin Personal de la Historia de la

Una Visión Personal de la Historia de la Biología Molecular desde el Descubrimiento que el material genético es el ADN (DNA) hasta el Desciframiento del Genoma Humano Relato de un Testigo Curso Teórico Práctico de Biología Molecular y Genómica www. laboratoriosportatiles. cl JORGE E. ALLENDE Enero 2 -5, 2018

• Para aprender Ciencias hay que hacer ciencias, para las ciencias experimentales esto significa que los estudiantes deben hacer experimentos que demuestren algún Concepto Fundamental que se está enseñando. • En la educación media en Chile, y en otros países de América Latina, se hacen muy pocos trabajos experimentales. • Relato sobre una innovación en la Enseñanza de la Biología en Educación Secundaria que se está probando en Chile y otros 5 países latinoamericanos y que permite que estudiantes hagan experimentos de la Biología del Siglo XXI en sus Liceos. 2

• En 1998 organizamos un curso teórico-práctico para capacitar profesores de Biología en Biología Molecular. • Ese curso se repitió en Chile y con apoyo de RELAB y UNESCO organizamos un curso el año 2003 para profesores de Biología de varios países latinoamericanos. • Este curso que se repitió el 2005 en Buenos Aires y el 2006 en Costa Rica con alumnos de muchos países de Centro América. • En general los cursos fueron muy bien recibidos por los profesores que nos decían que habían aprendido mucho. Pero algunos se mostraban frustados por no poder compartir con sus alumnos la parte más didáctica y más entretenida del curso- la parte experimental. • En Roma el año 2001 en la Academia Pontificia de la Ciencia, presenté un trabajo que se publicó en un libro, y en este yo decía que estábamos desarrollando un laboratorio portátil. 3

NOVEMBER 2001 Paper of J. E. Allende The problems and Promises of Science Education in Chile In our Institute of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, University of Chile, we are actively working with biology teachers in the public schools of Santiago, running courses on morphology, physiology, genetics and molecular biology. In this last subject we have developed a practical one week course in which we have trained more than one hundred high school teachers. It is great to see the excitement of these teachers when they can clone genes and transform bacteria and isolate DNA. We have the project of developing a mobile DNA laboratory that can visit schools and let the students carry out experiments of genetic engineering

Proyecto Wellcome Trust para “Difundir las Ciencias de la Vida en la Sociedad” 2011 2012 RELAB presentó proyecto en el año 2011 con 3 países participantes con una Universidad de cada país: México – UNAM Costa Rica – Universidad de Costa Rica Chile – Universidad de Chile Se aprueba proyecto con USD$ 48. 000 Actividades: 1. - Organización de Cursos Teórico-Prácticos en Biología Molecular y Genómica para Profesores de Biología en Educación Secundaria Cada país se organizaron cursos con similares contenidos que capacitaban y actualizaban a los profesores en 4 conceptos fundamentales de la Biología Molecular y Genómica. Estos cursos son de carácter intensivo y tenían 40 horas de clases, experimentos y discusiones que se dictan de lunes a viernes. 2. - Visita a los Liceos Los profesores que aprueben los cursos pueden solicitar la visita del laboratorio portátil al liceo donde ellos trabajan. Los profesores dictan las clases teóricas a sus alumnos y participan en la organización de los experimentos que usando el “laboratorio portátil” hacen sus alumnos con la asesoría técnica de los estudiantes de postgrado de la Universidad que acompañan al laboratorio portátil. Esto último es clave porque permite el contacto entre los estudiantes de media con los estudiantes de postgrado de las Universidades y este diálogo es tremendamente beneficioso para los dos tipos de estudiantes. Los liceanos ven que hay jóvenes chilenos que se han embarcado en una vida dedicada a la ciencia y los de postgrado adquieren una experiencia clave en transmitirle a la sociedad el porqué es importante que se cultive las ciencias. 5

Conceptos Fundamentales Cubiertos en este curso con Clases Teóricas y Experimentales • Concepto Fundamental 1 • La identidad de las especies y de los individuos esta determinada por la información genética contenida en la estructura del ADN de esas especies e individuos • El Fenotipo depende del Genotipo

Premio Nobel de Medicina 1993 7

From Phenotype to Genotype – The taste receptor for PTC De Fenotipo a Genotipo Mutation of Taste Receptor TAS 238 Se amplifica un fragmento del Receptor Gustativo TAS 238 que tiene 220 pares de bases y se corta con enzima de restricción Hae 3 que reconoce secuencia GGCC. Corta en gustadores y no corta en los no gustadores. PCR gano Premio Nobel de Química el año 1993. 177 221 44 8

Conceptos Fundamentales Cubiertos en este curso con Clases Teóricas y Experimentales • • Concepto Fundamental 2 La mayoría de las células de los organismos multicelulares contienen la misma información genética que el total del organismo pero esas células presentan diferencias en morfología y expresan proteínas diferentes que les permiten cumplir diferentes funciones fisiológicas. Esto está mediado por la regulación de la expresión genética. • • Concepto Fundamental 3 El Código Genético que se usa para traducir la información genética para generar proteínas es prácticamente universal en todos los seres vivos que habitan o habitaron en nuestro planeta y la maquinaria usada para lograr la traducción es también muy similar en diferentes seres vivos. Estos dos hechos son la base para poder hacer ingeniería genética permitiendo que el material genético que es introducido en células vivas de otra especie pueda ser correctamente expresada en la célula receptora. • Experimento de Transgénesis con gen de proteína fluorescente verde en bacterias – Plasmidio y foto de bacterias fluorescentes. Alumnos usan la proteína cuyo descubrimiento ganó el Premio Nobel de Química el 2008.

Se trasnsforma a E. coli con este ADN circular que contiene varios genes Apaga expresión Plasmidio p. GLO Transfección en E. coli

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Poleron de Alumnas Liceo 7 12

Conceptos Fundamentales Cubiertos en este curso • Concepto Fundamental 4 • La evolución Darwiniana puede ser investigada por medio de un estudio comparativo de las secuencias nucleótidicas de los genes o de las secuencias de aminoácidos presentes en las proteínas codificadas por esos mismos genes presentes en especies relacionadas. La genómica molecular nos aporta información sobre la escala de tiempo en la cuál las diferentes ramas filogenéticas fueron emergiendo en el proceso evolutivo. • Experimento computacional entrando a banco de datos (NCBI) que tienen la estructura de millones de genes y de las proteínas que estos genes codifican. • Uno introduce la información de un gen y usa un software llamado BLAST que busca todos los genes similares al humano.

REVOLUCIÓN DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR AÑO DESCUBRIMIENTO INVESTIGADORES 1944 DNA es el material que tiene la información Genética. The Professor, the Institute and DNA, René J. Dubos Experimento de Avery Oswald Avery (Pneumococus) 1949 Las proteínas están determinadas genéticamente. La hemoglobina de las células falciformes – Hb S. Medicina Molecular. L. Pauling y H. Itano Biografía - Force of Nature Linus Pauling * Electroforesis de proteínas Las moléculas de DNA son cadenas que forman una doble hélice. Nature, 1953 El Dogma Central de la Biología Molecular. J. Watson * y F. Crick 1953 F. Sanger Secuencia de insulina

PNEUMONIA EXPERIMENTO DE GRIFFITH

OSWALD AVERY Y LA TRANSFORMACIÓN CON ADN ILUSTRACIÓN ERRÓNEA

EXPERIMENTO DE HERSHEY - CHASE

EXPERIMENTO DE HERSHEY-CHASE

AÑO DESCUBRIMIENTO 1944 DNA es el material que tiene la Oswald Avery (Pneumococus) información Genética. The Professor, the Institute and DNA, René J. Dubos Experimento de Avery 1949 Las proteínas están determinadas genéticamente. La hemoglobina de las células falciformes – Hb S. Medicina Molecular. L. Pauling y H. Itano Biografía - Force of Nature 1953 INVESTIGADORES Linus Pauling * Electroforesis de proteínas F. Sanger Secuencia de insulina Las moléculas de DNA son cadenas J. Watson * y F. Crick que forman una doble hélice. Nature, 1953 El Dogma Central de la Biología Molecular.

Carta de Pauling a Itano en 1950 • “Creo que la Medicina está en este momento entrando a una nueva era en que los avances serán mucho más rápidos que antes, cuando los científicos descubrirán las bases moleculares de las enfermedades y descubrirán el por qué moléculas de ciertas drogas resultan en tratamientos eficientes, mientras que otras moléculas no son efectivas. • Tuve el honor de conocerlo en Santiago en 1964, y haber conversado con él por más de una hora en mi laboratorio. »

AÑO DESCUBRIMIENTO 1944 DNA es el material que tiene la Oswald Avery (Pneumococus) información Genética. The Professor, the Institute and DNA, René J. Dubos Experimento de Avery 1949 Las proteínas están determinadas genéticamente. La hemoglobina de las células falciformes – Hb S. Medicina Molecular. L. Pauling y H. Itano Biografía - Force of Nature 1953 INVESTIGADORES Linus Pauling * Electroforesis de proteínas F. Sanger Secuencia de insulina Las moléculas de DNA son cadenas J. Watson * y F. Crick que forman una doble hélice. Nature, 1953 El Dogma Central de la Biología Molecular.

EL DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR – NOV. 1952 Libro de Double Helix, 1968 de J. D. Watson Fenotipo Genotipo

Según el sueño de Crick POLIRRIBOSOMAS La idea de Crick

Watson en mi casa en la Reina

Mi clase de Medicina de 1961 AÑO DESCUBRIMIENTO 1960 Teoría del RNA mensajero Jacob* y Monod* La Estatua Interior 1987 Tomando Té el Viernes Santo de 1960 en la casa de Brenner 1961 Uuu es fenilalamina Piedra Rosetta del código Mi fracaso como futurologo 1961 -1965 Se completa el código genético INVESTIGADORES M. Niremberg*, Ochoa*, Khorana* 1962 -1967 Mecanismo de traducción para Lipmann* y varios síntesis de proteínas. laboratorios Mi participación en el laboratorio Lipmann y posteriormente en el de Niremberg

Mi clase a Estudiantes de Medicina y Predicción 1961 El DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

Mi clase de Medicina de 1961 AÑO DESCUBRIMIENTO 1960 Teoría del RNA mensajero Jacob* y Monod* La Estatua Interior 1987 Tomando Té el Viernes Santo de 1960 en la casa de Brenner 1961 Uuu es fenilalamina Piedra Rosetta del código Mi fracaso como futurologo 1961 -1965 Se completa el código genético INVESTIGADORES M. Niremberg*, Ochoa*, Khorana* 1962 -1967 Mecanismo de traducción para Lipmann* y varios síntesis de proteínas. laboratorios Mi participación en el laboratorio Lipmann y posteriormente en el de Niremberg

1961 -1965 -universal -degenerado -sin comas pero con punto aparte

Mi clase de Medicina de 1961 AÑO DESCUBRIMIENTO 1960 Teoría del RNA mensajero Jacob* y Monod* La Estatua Interior 1987 Tomando Té el Viernes Santo de 1960 en la casa de Brenner 1961 Uuu es fenilalamina Piedra Rosetta del código Mi fracaso como futurologo 1961 -1965 Se completa el código genético INVESTIGADORES M. Niremberg*, Ochoa*, Khorana* 1962 -1967 Mecanismo de traducción para Lipmann* y varios síntesis de proteínas. laboratorios Mi participación en el laboratorio Lipmann y posteriormente en el de Niremberg

Grupo del Laboratorio del Dr. Lipmann 1962

En Reñaca 1963

PUBLICACIONES DE J. E. ALLENDE sobre la Síntesis de Proteínas DANIEL NATHANS, 2 JORGE E. ALLENDE, 3 THOMAS W. CONWAY, 4 GEORGE J. SPYRIDES, AND FRITZ LIPMANN, PROTEIN SYNTHESIS FROM AMINOACYL s. RNA’s Symposium on Informational Macromolecules JORGE E. ALLENDE, † ROBIN MONRO, AND FRITZ LIPMANN. RESOLUTION OF THE E. COLI Academic Press, NEW YORK, 1963 COMPLEMENTARY pp. 349 -365 AMINOACYL s. RNA TRANSFER FACTOR INTO TWO FRACTIONS PNAS. USA. 51, 1211 – 1216 (1964) Jorge E. Allende, Robin Monro and Fritz Lipmann Reprinted from the Proceedings of the National Academy of Sciences Vol. 54, N. 6, pp. 1211 -1216, July, 1964* JORGE E. ALLENDE, AND HERBERT WEISSBACK (1964) GTP INTERACTION WITH A PROTEIN SYNTHESIS INITIATION FACTOR PREPARATION FROM ESCHERICHIA COLI BIOCHEN BIOPHYS. RES. COMM. 28, 82 -88, 1967 By JORGE E. ALLENDE, † NICHOLAS W. SEEDS, ‡THOMAS W. CONWAY, ‡ AND HERBER WEISSBACH § GUANOSINE TRIPHOSPHATE INTERACTION WITH AN AMINO ACID POLYMERIZATION FACTOR FROM E. COLI* PNAS. , USA 58, 1566 – 1573 (1467

1962 -1968 Mayormente en U. S. A. Etapa en la que participé activamente

1963 -1966 En Chile Aminoacil – t. RNA Sintetasas Las enzimas inteligentes que son bilingües Catalizan reacción 1. - Amino acido (X) + ATP + Enz -------> amino acido (X)-AMP-ENZ+P-P <-------2. - Amino acido (X) - ATP – Enz + + RNA(X) -------> AAx-t. RNA(X) + AMP + ENZ AA (X) + ATP + t. RNA -------> AA (X) – t. RNA(x) +AMP+P-P <-------ENZ v. Allende, C. C. , and Allende, J. E. (1964) Purification and substrate specificity of arginyl-ribonucleic acid synthetase from rat liver. J. Biol. Chem. 239, 1102 -1106. v. Allende, J. E. , Allende, C. C. , Gatica, M. , and Matamala, M. (1964) Isolation of threonyl adenylate-enzyme complex. Biochem. Biophys. Res. Commun. 16, 342 -346. v. Allende, C. C. , Allende, J. E. , Gatica, M. , Celis, J. , Mora, G. , and Matamala, M. (1966) The aminoacyl ribonucleic acid synthetases: I. Properties of the threonyladenylate-enzyme complex. J. Biol. Chem. 241, 2245 -2251. v. Allende, C. C. , Chaimovich, H. , Gatica, M. , and Allende, J. E. (1970) The aminoacyl transfer ribonucleic acid synthetases: II. Properties of an adenosine triphosphate-threonyl transfer ribonucleic acid synthetase complex. J. Biol. Chem. 245, 93 -101.

AÑO Descubrimiento Investigadores 1969 Transcriptasa Reversa Retrovirus pueden sintetizar DNA a partir de RNA (flecha 4) Baltimore * y Temin * 1963 -1972 Enzimas de restricción cortan DNA en sitios específicos – trozos manejables. Arber* Brown* Nathans* 1973 Plasmidios – circulitos de DNA de las bacterias sirven para introducir DNA de otras especies a bacterias. Berg*, Cohen*, Boyer 1977 Método para determinar la secuencia del DNA. • Con esto se hace posible la ingeniería genética y surge la biotecnología. • Bacterias sintetizan insulina humana y hormona de crecimiento humana “la biología del terror”. Gilbert, *Sanger* 1979 • Genes de escariontes están interrumpidos por intrones 1981 Animales transgénicos – ratones Palmiter, Brinster 1983 Plantas Transgénicas usando Agrobacterium tumefasciens Van Montagu y Schell 1985 Reacción de la Polimerasa en cadena – Amplifica DNA millones de veces (PCR). Mullis*

1970

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Y DNA RECOMBINANTE

Plasmidos Recombinantes

Método DIDEOXI nucleótidos Sanger

Agrobacterium tumefaciens Plantas Transgénicas bacterial chromosome T-DNA border region Ti plasmid T-DNA vir genes In response to chemical signals, the vir genes become activated and direct a series of events to transfer the T-DNA to the plant cell.

MARK VAN MONTAGU-SALA SAZIÉ – FAC. DE MEDICINA

2001 • La gran sorpresa que nos dio el texto completo de las secuencias del genoma es que el ser humano solo tiene ~ 26000 genes que es igual al de los ratones y mucho menos que algunas plantas y animales. Golpe a nuestro orgullo. Solo el 3% del Genoma codifica para proteínas. • Esto nos presentó con el concepto del “DNA basura” y que la complejidad humana no se basa en genes sino más bien en sus interrelaciones.

• Con el genoma aparecen nuevos enfoques que buscan encontrar la base de esas interrelaciones – los microconjuntos. • No hay relaciones de causa efecto lineales sino que estímulos y señales encienden o apagan circuitos enteros de cientos de genes. • PROYECTO ENCODE • Se vuelve a examinar el genoma en un trabajo laborioso que se inicia el 2003 y sigue actualmente que se encuentra que el 80% del genoma se usa para activar o reprimir genes. • Septiembre 6 del año 2012 – Se publica la Enciclopedia de elementos del DNA (ENCODE) y el 60% del genoma se transcribe. Esto nos dice que prácticamente gran parte del trabajo con microconjuntos es irrelevante porque estábamos mirando al 3% que codifica proteínas y olvidándonos del 80% que tiene función. Esto quiere decir que hay 34 millones de elementos en el genoma que cumplen funciones y esa es una complejidad apabullante. En este momento realmente no sabemos como atacar esa complejidad.

• Nuevamente, las bacterias nos dan la pista para una nueva metódica de ingeniería de genomas. • (CRISPR-Cas 9) - Esta metódica esta causando una nueva revolución en la biotecnología pero también ha causado la preocupación desde el punto de vista ético en cuanto se podría usar en la línea germinal humana.

SCIENCE EXPRESS - PERSPECTIVES, 19 March 2015

• La nueva generación de secuenciadores permite tener un perfil genómico de una persona por poco más de lo que cuesta una resonancia magnética nuclear. • Medicina personalizada