Umbilikalna krv kao izvor matinih elija hematopoeze banke

Umbilikalna krv kao izvor matičnih ćelija hematopoeze – banke za umbilikalnu krv Profesor Dejan Škorić

MATIČNE ĆELIJE HEMATOPOEZE • Pluripotentne matične ćelije hematopoeze (PMĆH) formiraju zrele ćelije krvi i imune ćelije. • PMĆH su nediferentovane ćelije koje imaju sposobnost samoobnavljanja, proliferacije, diferencijacije u pravcu raznih specijalizovanih ćelija krvi, usađivanja u odgovarajuću mikrosredinu i mobilizacije iz kostne srži (KS) u perifernu krv (PK). • PMĆH su veoma retke jer je samo 1 od 10. 000 ćelija sa jedrom u KS pluripotentna MĆH. U UK 1 od 1000 ćelija sa jedrom je MĆH.

MATIČNE ĆELIJE HEMATOPOEZE • Pluripotentne MĆH se diferentuju u pluripotentne progenitore (PP). Daljom diferencijacijom iz njih nastaju pluripotentni mijeloidni progenitori (PMP) i pluripotentni limfoidni progenitori (PLP). Od PMP i PLP nastaju progenitori opredeljeni za dve ili samo jednu lozu. Ovi poslednji se nazivaju opredeljeni progenitori. • Pluripotentne MĆH i progenitorske ćelije nisu morfološki prepoznate i jedini morfološki parametar kojim su ove ćelije definisane je, da pripadaju mononuklearnoj ćelijskoj subpopulaciji i da su veličine malog limfocita. • Daljom diferencijacijom opredeljenih progenitora nastaju morfološki prepoznatljive ćelije, koje se nazivaju prekursorske ćelije i iz kojih sazrevanjem nastaju zrele krvne ćelije (Slika 1).

Slika 1. Šematski prikaz hematopoeze. Sa leve strane se nalaze uobičajene kombinacije antigena koje odgovaraju određenom stepenu diferencijacije, a sa desne strane su prikazani in vivo i in vitro testovi za identifikaciju MĆH, progenitorskih ćelija i zrelih ćelija krvi (preuzeto iz Lord i sar. , Stem Cells, 1997).

IZVORI MATIČNIH ĆELIJA HEMATOPOEZE • Kostna srž (Thomas i sar. , 1957) • Periferna krv (Goldman i sar. , 1979) 90% Autologih TMĆH i 60% Alogenih su iz PK • Umbilikalna krv (Gluckman i sar. , 1989)

PODELA ALOGENIH TMĆH PREMA VRSTI DAVAOCA • singene – davalac je identičan blizanac • alogene od srodnog-podudarnog davaoca (30%) • alogene od nesrodnog-podudarnog davaoca (50 -80% – KS ili PK) • alogene od nesrodnog-nepodudarnog davaoca (15 -30% → UK)

UMBILIKALNA KRV KAO IZVOR MĆH (Istorijat) • Gluckman i saradnici su 1988. godine izveli prvu transplantaciju MĆH iz UK u dečaka sa FA. Davalac je bila njegova HLA-podudarna sestra (Gluckman i sar. , 1989). • Početkom 90 -ih, urađene su prve TMĆH iz UK od nesrodnih davalaca, a 1992. i 1993. formirane su prve banke za UK (Njujork, Milano i Diseldorf) (Rubinstein i sar. , 1993). • Krajem 90 -ih godina je započeto je i intenzivno korišćenje UK za transplantaciju u odraslih bolesnika (Laughlin i sar. , 2001). • U toku 2004. godine, ustanovljeni su kriterijumi za indikacije i izbor uzoraka UK za TMĆH (Gluckman i sar. , 2004).

BANKE ZA UK • U današnje vreme ima preko 750. 000 kriokonzervisanih uzoraka UK (u 158 javnih banaka), dostupnih za alogenu TMĆH. Pretraživanje uzoraka UK se vrši preko Netcord organizacije (Ballen i sar. , 2016). • U privatnim bankama se nalazi 4000. 000 uzoraka UK • Do sada je ukupno urađeno preko 40. 000 TMĆH iz UK i oko 20% alogenih TMĆH poslednjih godina urađeno iz UK (Peberdy i sar. , 2016).

BANKE ZA UK • Na osnovu svetskih iskustava, procenjuje se da je na 10 miliona stanovnika potrebno prikupiti između 2000 do 10. 000 uzoraka • Doniran uzorak UK postaje vlasništvo javne banke, za razliku od privatnih banaka, gde je uzorak namenjen isključivo za potrebe porodice • Verovatnoća da se uzorak UK iz javne banke iskoristi je oko 4% za period od 11 godina, dok je u privatnim bankama zanemarljivo mala, tako da privatne banke u medicinskom smislu za sada nisu opravdane. • Medicinska opravdanost privatnih banaka će verovatno biti ostvarena u budućnosti, kada se razvije regenerativna medicina, i MĆH iz UK budu rutinski primenjivane u lečenju brojnih krdioloških, neuroloških, hepatoloških i drugih bolesti. • Ovo je moguće jer MĆH iz UK su multipotentne i imaju mogućnost regeneracije brojnih tkiva

Prednosti UK kao izvora MĆH (1) • Umbilikalna krv je neograničeno dostupan izvor MĆH. Formiranjem banaka za UK, potencijalno neograničen broj uzoraka UK može da se dugotrajno skladišti u njima • Nema rizika za davaoce umbilikalne krvi. Ako se primenjuju uobičajene ginekološke procedure, prikupljanje UK je potpuno bezbedno po porodilju i novorođenče; • Umbilikalna krv je lako i brzo dostupan izvor MĆH. Zamrznuti uzorci u bankama za UK su godinama apsolutno dostupni za TMĆH, dok se godišnje se gubi iz registra (BMDW) oko milion dobrovoljnih davalaca KS ili PK i to zbog bolesti, gubitka volje za donaciju ili smrti. • Redukovana incidenca i težina GVHD posle TMĆH iz UK i pored HLAnepodudarnosti (2 HLA-nepodudarnost)

Nedostaci UK kao izvora MĆH (1) • Uzorci UK imaju manji broj MĆH u odnosu na kalem iz KS ili PK. Kalem iz KS ima 10 puta više CD 34+ ćelija od prosečnog uzorka UK, a kalem iz PK i do 100 puta više. Ćelijska doza je najznačajniji faktor za prognozu TMĆH iz UK: (1, 7 x 105 CD 34+/kg) • Umbilikalna krv se može samo jednom prikupljati (posle porođaja) – nema mogućnosti da se matične ćelije hematopoeze ponovo prikupljaju od istog davaoca

Strategije za uvećanje ćelijske doze iz UK • Poboljšanje metodologije prikupljanja i kriokonzervacije uzoraka UK • Simultana transplantacija 2 uzorka UK – dvostruka TMĆH iz UK • Ex vivo ekspanzija MĆH iz UK

Prikupljanje uzoraka UK – metodi – In utero metod – Ex utero metod – Kombinovani metod

Kriokonzervacija uzoraka UK • Prilikom kriokonzervacije kalema iz KS ili PK nije neophodno da oporavak ćelija bude optimalan, jer obično u kalemu pre kriokonzervacije ima „višak“ MĆH. • Suprotno od KS i PK, u UK se nalazi inicijalno mali broj MĆH, tako da je neophodno da kriokonzervacija bude optimalna, tj. da što je moguće veći broj ćelija preživi zamrzavanje.

Naša iskustva • Prvi uzorak UK u Srbiji je prikupljen u junu 2000. godine (Škorić D, Sinđić M) • Kasnije je prikupljeno preko 200 uzoraka upotrebom aktivnog i standardnog in utero metoda • Škorić D. , Balint B. , Petakov M. , Sinđić M. , Rodić P. : Collection strategies and cryopreservation of umbilical cord blood. Transfus Med. 2007 Apr; 17(2): 107 -13

Tabela 1. Rezultati prikupljanja UK upotrebom aktivnog i standardnog in utero metoda Statistička značajnost Metod prikupljanja Grupa A Grupa B Broj uzoraka 49 50 Zapremina (ml)* 103 ± 35 86 ± 29 p<0, 05 Medijana (ml) 97 81 p<0, 05 Min. vrednost (ml) 50 51 Max. vrednost (ml) 172 135 Odbačeni uzorci (%)** 14 36 p<0, 01 Bakterijska kont. (%) 2. 04 2. 0 NSZ *Srednja vrednost ± standardna devijacija **Odbačeni uzorci su manji od 50 ml i/ili imaju manji apsolutni broj NĆ od 8 x 108 NSZ = nema statističke značajnosti

Grafikon 1. Procedura programiranog zamrzavanja se sastoji od 5 faza: I = 5°C/min, 4 minuta ; II = 0°C/min, 5 minuta (ekvilibracija); III = 2°C/min, 5 minuta; IV = 1°C/min, 35 minuta; V = 5°C/min, 5 minuta.

Prikupljanje uzoraka UK-uticaj ginekoloških faktora • Na zapreminu uzorka UK pored metoda prikupljanja utiču i ginekološki faktori • U svim studijama je potvrđeno da telesna težina novorođenčeta (TT) i težina placente (TP) utiču na zapreminu i broj ćelija, tj. veća TT i TP obezbeđuju uzorke sa većom zapreminom i brojem ćelija. • Otkriveno je da na zapreminu uzoraka utiče i dužina pupčanika (duži pupčanik/↑v), broj prethodnih trudnoća (prvorođeno dete/↑v), gestacijski uzrast (duže trajanje trudnoće/↑v), način porođaja (Carski rez/↑v) i pol deteta.

Tabela 2. Uticaj ginekoških faktora na kvalitet uzoraka umbilikalne krvi (TT i TP) (broj uzorka = 62) TT (2500 g − 3300 g); TP (600 g − 700 g) (broj uzoraka = 37) Zapremina (ml) * 96 ± 35 74 ± 22 p<0, 05 NĆ* (x 10/8) 12, 5 ± 5, 3 9, 2 ± 5, 7 p<0, 05 CD 34+* (x 10/6) 3, 9 ± 1, 4 2, 9 ± 1, 2 p<0, 05 CFU-GM* (x 10/4) 104, 1 ± 24, 7 64, 3 ± 18, 5 p<0, 01 TT > 3300 g; TP > 700 g *srednja vrednost ± standardna devijacija (SD)

HVALA! Kontaktirajte nas: 011 -2060690