UE Agents infectieux Hygine Aspects gnraux TP N

UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux TP N° 1 Diagnostic bactériologique Ensemencements Observations microscopiques Mise à jour le:

Plan et Objectifs (p. 3) – Bactéries de l’environnement et des flores – Démarche du diagnostic bactériologique et de l’antibiogramme – Réalisation et isolement d'un prélèvement à l'écouvillon de collet dentaire – Isolement d’une urine sur gélose CLED en méthode quantitative – Ensemencement d'un antibiogramme à partir d'un isolement d'une souche bactérienne – Observation microscopique avec l'objectif à immersion de frottis bactériens colorés par la méthode de Gram UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux

Bactéries - généralités Procaryotes, forme bacille (allongé) ou cocci (rond), divisés selon la coloration de Gram • Famille : Enterobacteriaceae (Entérobactéries) • Genre : Escherichia • Espèce : Escherichia coli (colibacille) UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux

Bactéries de l’environnement et des flores Bactéries de l'environnement (>106 espèces ? ) Bactéries commensales (flores ~105 espèces) Bactéries pathogènes (~102 espèces) • Environnement: eau, sol, poussières… • Flores: cutanée, oropharyngée, digestive • Pathogènes: spécifiques / opportunistes (CF cours magistral) UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux

Bactéries de l’environnement • Prenez la boite de Pétri intitulée « TCS » • Notez vos noms et groupe sur l’étiquette • Laissez la ouverte sur la paillasse, le temps de la séance Dépôt des poussières de l’air sur la gélose UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux

Diagnostic bactériologique direct et indirect • Diagnostic direct: Recherche de la bactérie ou d’un de ses constituants. – – Microscopie Culture Recherche d’antigènes solubles Recherche d’ADN bactérien (PCR) • Diagnostic indirect: Recherche de la réaction immunitaire de l’hôte contre la bactérie. – Sérodiagnostic (anticorps) – Intradermo réaction (immunité cellulaire) UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux

Démarche du diagnostic bactériologique direct (p. 28) • Le jour même : – Prélèvement (récipient stérile, avant antibiothérapie !) – Examen microscopique (cytologie et Gram) – Diagnostic moléculaire / Recherche d’antigènes bactériens – Mise en culture • Le lendemain : – Résultats des cultures – Identification et Antibiogramme • Le surlendemain : – Lecture de l’antibiogramme UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux

Le prélèvement • Selon la symptomatologie (site) – – Fièvre élevée / frissons hémocultures Abcès, suppuration ponction / écouvillon Signes d’infection urinaire ECBU Signes méningés LCR • Tube, écouvillon, pot stériles (bouchon rouge) • Après désinfection cutanée si ponction • Transport rapide au laboratoire selon le type: – LCR (++urgence, germes fragiles sensibles au froid) – Urines (éviter pullulation dans le pot, germes résistants au froid +4°C si délai) UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux

Examen direct - Cytologie • Cytologie – Recherche de polynucléaires neutrophiles (signe d’inflammation) – Quantitative si liquide (urines, LCR, pleural…) Microscope Lamelle Leucocyte Cellule Quadrillage Hématie Formule leucocytaire (May Grunwald Giemsa) pour le LCR - Qualitative si pus (coloration de Gram) UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux

Examen direct - Gram • Coloration de Gram: Violet de gentiane décoloration (alcool+acétone) contre coloration rose (fuchsine) – Bactéries à Gram positif : colorées en violet – Bactéries à Gram négatif : colorées en rose Cocci à Gram positif Cocci à Gram négatif Bacilles à Gram positif Bacilles à Gram négatif UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux

Examen direct – Gram (p. 25) Mbne externe Porine Paroi épaisse, retient la coloration violette lors de la décoloration Peptidoglycane PLP Mbne plasmique Gram Bacilles : -Entérobactéries -Pseudomonas -Haemophilus -Bacteroïdes (anaérobie) …. Cocci : -Neisseria -Moraxella …. Gram + Bacilles : -Bacillus -Lactobacillus -Corynebacterium -Listeria -Clostridium (anaérobie) …. Cocci : -Staphylococcus -Streptococcus -Enterococcus …. Bactéries invisibles au Gram: -Mycobactéries (BAAR: coloration de Ziehl) -Spirochètes (très fins: microscope à fond noir) -Mycoplasmes (absence de paroi) -Chlamydiae (intracellulaires stricts) UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux

Examen direct - Gram Ne pas confondre cellules humaines et bactéries ! Leucocyte : ~20 µm Bactérie : ~1 µm UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux

Examen direct - Gram • Peu ou pas de polynucléaires, bactéries polymorphes Image évoquant une flore commensale • Polynucléaires neutrophiles (inflammation) + Bactéries monomorphes +/- Images de phagocytoses Image évoquant un processus infectieux L’aspect des bactéries au Gram donne une indication sur la famille Traitement ATB probabiliste UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux

Recherche d’antigènes solubles • Ag solubles = morceaux de bactéries mortes (capsule, paroi) • Recherché dans les liquides biologiques (LCR, urines, ponction…) • Avec antisérum spécifique d’une bactérie Bille latex sensibilisée (Ac) Agglutination Bandelette d’immunochromatographie UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux

Mise en culture du prélèvement • Milieux de culture et durée de culture selon les germes recherché : – Mycobactéries : Milieux spéciaux, culture lente (qqs sem. à qqs mois) – « Bactéries courantes » : (24 -48 h) • Si prélèvement normalement stérile (ex : LCR) : Milieu « riche » et bouillon de culture (milieu liquide) • Si prélèvement normalement polymicrobien (ex : selles) Milieu sélectif • Bactéries ne cultivant pas sur milieux usuels : Mycoplasmes, chlamydiae, tréponèmes… UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux

Mise en culture du prélèvement (p. 8): Technique de l’isolement en quadrant • Objectif : obtenir une colonie bactérienne isolée 1 - Dépôt du prélèvement (écouvillon) 4 - stries à l’öse : 4ème quadrant (sans repasser par la 1ère moitié de la boite) 2 - stries à l’öse : 1ère moitié de boite 3 - stries à l’öse : 3ème quadrant Colonies isolées dans le dernier quadrant Incubation 24 h à 35 -37°C UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux

Exercice N° 1 : ensemencez un prélèvement de collet dentaire • • Prenez la gélose au sang (rouge) Notez nom + groupe / étiquette Écouvillonnez votre binôme Déposez la pointe sur la gélose (frottez doucement) • Prenez une öse plastique et faite l’isolement en quadrant UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux

Numération des bactéries dans un liquide : exemple de l’ECBU (p. 9) • Objectif : Numération des colonies après ensemencement de 10 µL (anse/öse calibrée) 10 µL urines Incubation 24 h à 35 -37°C UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux

Exercice N° 2 : Ensemencement quantitatif d’une « urine » 1. 2. 3. 4. Prenez une anse/öse plastique calibrée 10µL Trempez la dans la suspension bactérienne Etaler sur un rayon de la gélose CLED (verte) Réaliser des stries serrées en partant du début de l’étalement 1 2 3 4 10 µL UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux

Identification des bactéries • Uniquement si culture positive ! ! ! – Prélèvement d’une colonie isolée – Examen microscopique : E. F. (mobilité), Gram – Tests biochimiques réalisés sur colonies : exemple: acidification ou non des sucres Bactéries + Sucre + indic. p. H Bactéries Acide Changement de couleur Galerie d’identification -Tests d’agglutination avec des anticorps (sérogroupage, sérotypage) - Nouvelle méthode : spectrométrie de masse UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux

Antibiogramme (p. 12) • But : Tester la sensibilité / résistance de la bactérie vis-à-vis de plusieurs ATB • Principe : Mesure du diamètre d’inhibition de la culture autour d’un disque imprégné d’ATB se décharge en qq sec, créant un gradient de concentration ATB R [C] d’ATB [C] = CMI ATB culture bactérienne diffusion [C]= 1/d UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux ATB S Diamètre d’inhibition de la culture

Exercice N° 3 : Ensemencement d’un antibiogramme • Prenez la gélose marquée MH : notez sur l’étiquette vos nom et groupe • Avec une öse prélevez une colonie d’une culture (notez sur l’étiquette de la gélose « E. coli » ou « staph » selon la bactérie prélevée) et dissociez la dans le tube d’eau stérile 1 Eau stérile UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux 2

Exercice N° 3 : Ensemencement d’un antibiogramme • Prenez un écouvillon stérile, le tremper et l’agiter le dans la suspension de bactéries • Etalez sur l’ensemble de la boite Dépôt des disques d’ATB 3 4 5 UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux 6

Observation des lames colorées au Gram • Utilisez l’objectif marqué « 100 » • Pour obtenir une image nette, il faut déposer une goutte d’huile entre l’objectif et la lame • Utiliser la roue macrométrique jusqu’à ce que l’objectif touche la goutte d’huile, puis la roue micrométrique jusqu’à obtention d’une image nette Roue macrométrique Roue micrométrique UE: Agents infectieux – Hygiène – Aspects généraux