UE 8 Master 1 2006 2007 Biopathologie et

UE 8 Master 1 2006 -2007 Biopathologie et Biotechnologies: de la recherche fondamentale aux applications médicales UFR Médecine Université de Nice Sophia Antipolis

Thémes abordés en 2005 (1) Module 1 • Les centres de ressources biologiques • Principes de méthodologie générale en Pathologie • La microdissection par capture laser • Les tissue microarrays • Les biopuces à ADN • La microscopie électronique • La protéomique

Thémes abordés en 2005 (2) Module 2 • L’apoptose et son approche méthodologique • La thérapie cellulaire à travers la pathologie musculaire • La biopsie musculaire et ses applications • Approche transversale d’un projet de recherche (exemple 1) • Approche transversale d’un projet de recherche (exemple 2) • Organisation des laboratoires

Les Centres de Ressources Biologiques en 2007 Concept et intérêt actuel Laboratoire de Pathologie Clinique et Expérimentale Hôpital Pasteur-CHU de Nice

Tumorothèque • • • Quelques définitions Principes généraux La collecte des tissus et la préparation L’annotation dynamique des échantillons Le transport des échantillons L’archivage des échantillons Le système d’information La politique de cession et d’acquisition Exploitation et techniques d’aval Un exemple d’organisation générale Conclusion et perspective

Quelques définitions

• • Tumorothèque Tissuthèque Cellulothèque Sérothèque Clinithèque Biothèque Centres de Ressources Biologiques (CRB)

Principes généraux: Pourquoi une tumorothèque ?

Objectif général des tumorothèques • Développer de nouveaux outils diagnostiques et pronostiques dans le domaine de la cancérologie • Adapter rapidement les progrès de la biotechnologie au domaine de la santé

Objectifs ciblés des tumorothèques • 1) Un objectif médical : améliorer l’offre de soin en cancérologie – Répondre à la mise en place des techniques de biologie moléculaire et de génétique permettant à partir de tissus ou de cellules d’améliorer les possibilités de diagnostic des néoplasies malignes et d’établir leur pronostic – Permettre ainsi une optimisation des traitements et dans certains cas de proposer un conseil génétique et un suivi des familles

• 2) Un objectif en recherche – Faciliter l’interface avec les laboratoires de recherche fondamentale et bénéficier des progrès de la biologie pour progresser dans la connaissance physiopathologique du cancer – Transférer l’acquisition de résultats obtenus à partir de tissus humains à la recherche clinique et à la recherche appliquée

La collecte des tissus et la préparation des échantillons

Quelques impératifs : Congélation immédiate ou délai de congélation inférieur à 15 min Au mieux : sélection des zones d’intérêt par un pathologiste (contrôle macroscopique et microscopique)

Quels échantillons ? Fragments de pièce opératoire, biopsie, cellules, prélèvement autopsique….

Comment conditionner les échantillons ? • « Nettoyer » les tissus • Standardiser au mieux les volumes tissulaires avant congélation • Congéler immédiatement dans l’azote liquide ou dans l’isopentane ou conditionner l’échantillon dans du RNA later

L’annotation dynamique des échantillons

Le registre des prélèvements congelés • Fiche de transfert : nom du médecin responsable, heure du prélèvement et de la cryoconservation, délai de transfert • Date d’enregistrement • Protocole d’inclusion • Diagnostic lésionnel codé (code ADICAP) • Mémorisation des analyses réalisées Activité des tumorothèques labellisées par le Ministère de la Santé orientée vers certaines pathologies ++++

Le transport des échantillons

Les containers d’azote munis au mieux de « mouchard » sécurisation et traçabilité

L’archivage des échantillons

L’azote liquide Les capteurs d’oxygène

Les vapeurs d’azote Les capteurs d’oxygène

Les congélateurs à – 150°C

Le système d’information : Une source de difficultés

Le recueil des données et le logiciel de gestion de la tumorothèque • Les différents logiciels : logiciel « maison » et logiciel commercialisé (type crésalys) : la mise en cohérence avec les logiciels hospitaliers +++ • La mise en réseau à l’échelon national • La liste minimale des informations à recueillir – Identification du service et du médecin – Informations concernant le malade – Identification du prélévement – Eléments de gestion pour chaque prélévement – Traçabilité du prélèvement

Un exemple de coopération internationale

Tumors and non tumors tissue bank (1) DIFFERENT PARTNERS CHU CLCC University of Nice DHOS (2003) Canceropôle PACA CCI AM GRANTS AND SUPPORTS CHU-CLCC : 410 000 euros University : 110 000 euros DHOS : 120 000 euros Canceropôle : staff (3 technicians) Conseil Régional : 125 000 euros Conseil Général : 23 000 euros COLLECTIONS OF FROZEN TISSUES MAIN TOPICS : Head and Neck Pathology Pulmonary Pathology GI tract Pathology

Tumors and non tumors tissue bank (2) Infrastructure and human resources « Frozen tank » room (60 m 2 ) - 80°C - 150°C Bioinformatic - 80°C Human resources Technicians (3) Ingenior (1) Pathologist (1) Incub CO 2 Tissue preparation Culture cells RNA bank PSM - 150°C - 80°C Incub CO 2 - 80°C Bank Nitrogen - 80°C Culture and conditionning room (50 m 2) Connection to the Pathology Lab [Technicians (5) Pathologists (4)]

Tumors and non tumors tissue bank (3) Different steps required and making procedures: -1. Specimen stored in the bank must be accompanied by a signed agreement of the patient -2. Selection of representative specimen by a well trained pathologist -3. Freshly frozen specimen or frozen specimen after in an RNA protective solution -4. Time between the biopsy/surgical exicision and the frozen procedure less than 15 min -5. Visual control of a section from a « mirror sample » taken in regard of the frozen specimen -6. All specimen are weighted before freezing -7. Several specimens taken both in lesions and in adjaccent normal areas -8. Quantitative evaluation of the extracted RNA -9. Assessment of RNA quality by Bioanalyzer -10. Complete histopathological, epidemiological and clinical data -11. Possibility of integration of all experimental data with external information ressource -12. Collection of specimens kept in a securised local (permanent recording of the temperatures and central alarm) -13. Main data collected on an single sheet

Digestive tissue bank Department of GI tract Medecine LOCAL Department of GI tract Surgery Pathology Lab (Nice) NATIONAL Departments of Pathology (GI Tract Pathologists) Hotel Dieu Hospital C Laboisse Edouard Herriot Hospital JY Scoazec Saint Antoine Hospital JF Fléjou Cochin Hospital Pr B Terris INSERM UNIT Central Biobank Department of Informatic and Public Health Sheet of collecting and recording data Clinical data Histological data Images Bacteriological data Number and sites of biopsies Quantity of frozen tissue available

BIOBANK CENTER TEAM OF GI PATHOLOGISTS INSERM UNIT DNA chips * Pocedures * Bioanalyseur Agilent * Lecture PLATFORM OF DNA ARRAYS Sophia Antipolis TMA * Arrayers *Softwares * Discovery Ventana LCM PCR apparatus AVAILABLE ANTIBODIES (ACI Canceropole IPMC) BACTERIOLOGY LAB AND INSERM 627

La politique de cession et d’acquisition

De la Tumorothèque CHU-CAL-UNSA à un Centre de Ressources Biologiques Centre Hospitalo-Universitaire et Centre Antoine Lacassagne Faculté de Médecine de Nice Université de Nice Sophia Antipolis

Evolution vers un CRB

Evolution de la Tumorothèque depuis 2003 • Développement de la THC § Laboratoire de Pathologie Clinique et Expérimentale du CHUN § Tumorothèque Commune CHUN-CAL (GCS) - Projet DHOS (2003) Tumorothèque en Réseau (Projet INCa 2005) PNES Poumon (Projet INCa 2005) Tumorothèque Nationale Virtuelle (catalogue commun des collections) - Pôle de compétitivité [solutions communicantes; Puce RFID– projet Mistrals (2006)] . Tissuthèque non tumorale UNSA-Région - BQR de l’UNSA (2004) - Conseil Régional (2004) - Conseil Général (2004) Biobank

Centre de Ressources Biologiques • Ressources Biologiques accessibles aux chercheurs § Différentes ressources § Tissuthèque tumorale et non tumorale - ARN thèque (quantité/qualité) - ADN thèque (quantité/qualité) § Sérothèque, plasmathèque § Cultures primaires de cellules épithéliales néoplasiques et non néoplasiques § Intégration informatique de l’ensemble des annotations épidémiologiques, cliniques et tissulaires sur un logiciel dédié (Crésalys) § Informations sous forme de catalogue accessible (web) sur catalogue (Modulbio)(avril 2007) § Construction prospective de « tissue microarrays » sur les collections ciblées dans la THC (blocs tissulaires/protéines)

Infrastructure de la THC (Pavillon J Hôpital Pasteur)

Tumorothèque-Pavillon J-Hôpital Pasteur SALLE DE CRYOCONSERVATION SALLE DE CULTURE MICROSCOPIE ELECTRONIQUE Vestiaires ENTREE INTERIEURE INTERPRETATIONS EXTEMPORANES Pneumatique SALLE DES AUTOMATES ENREGISTREMENTS TISSUE MICROARRAYS SALLE DE REPOS BIOLOGIE MOLECULAIRE ENTREE EXTERIEURE MICRODISSECTION LASER BIOPUCES ET ANALYSES DES ACIDES NUCLEIQUES LAVERIE SALLE DE MACROSCOPIE SALLE D’IMMUNOHISTOCHIMIE SALLE DES COUPES SALLE DE CYTOLOGIE/HISTOLOGIE

Infrastructure et Ressources Humaines Salle de Culture et de conditionnement des échantillons Salle de Cryoconservation - 80°C - 150°C Biostatistiques - 80°C RH Techniciens CDI : 2. 3 Ingénieur : 1 Secrétariat dédié : 0. 3 Agent d’entretien: 1 CDD: 3 Incub CO 2 Tissue preparation Culture cells RNA bank PSM - 150°C - 80°C Incub CO 2 - 80°C Bank Nitrogen - 80°C Connection to the Pathology Lab [Technicians (5) Pathologists (4)]

Valorisation-Transfert Biobank

Cultures lignées primaires

ISET Plateforme d’Immunohistochimie

Biologie Moléculaire

Microdissection Laser

Plateforme de puces ADN/Tissue Arrays

Sécurisation Accès restreint Traçabilité Report d’alarme

Organisation et mode de fonctionnement

Organisation, Evaluation et Gestion • Comité de Pilotage CHU-CLCC: § Organisation Générale-Projets et Réponses aux Appels d’Offres § Liens avec la Direction de la Recherche Clinique et de l’Innovation et avec le Conseil Exécutif du CHU • Conseil Scientifique de la Tumorothèque: § 12 membres (cliniciens, chercheurs, membres extérieurs) - Représentants du CHU, du CLCC, de l’UNSA - Représentants de l’INSERM, du CNRS, et du CRB de l’agglomération marseillaise § Avis scientifique sur les projets (deux rapporteurs) - Avis des référents cliniciens et des pathologistes de la collection concernée • Avis du Comité de Protection des Personnes du CHUN • Collections déclarées à la CNIL depuis 2005 • Tarification (en cours d’évaluation par le DRCIV)

Projets ciblés

Principales Collections Actuelles § Pathologies Tumorales et Non Tumorales Ciblées § Recrutement § § Pathologie ORL - Thyroïde - Glandes salivaires - Carcinome épidermoïde Pathologie thoracique - Poumon - Plèvre - Médiastin § Autres - Pathologie infectieuse - Pathologie digestive - Pathologie hématologique

Collections (septembre 2004 -février 2007) 89 % 88. 5% 89. 6% Patients: 1877 inclusions % global de consentements : 89% Nombre d’échantillons : 17. 899 ARNthèque: 675 échantillons Pathologie tumorale: 1210 inclusions ADNthèque: 854 échantillons Pathologie non tumorale: 667 inclusions Plasma/sérum: 144 patients Lignées primaires de thyréocytes: 16

Fiche tumorothèque (1877 fiches disponibles) -Identification -Consentement - Prélèvement - Qualité

Projets retenus et soutenus • 22 Projets THC (déstockage de 3. 100/16. 300 échantillons) (2004 -2006) • Projets développés dans la Région de Nice Sophia Antipolis: § Projets des Unités INSERM 526 (P Auberger), INSERM 576 (A Bernard), INSERM 638 (A Schmid), INSERM ERI-21 (P Hofman), INSERM Avenir (G Lauvau), INSERM 634 (G Méneguzzi) § Projets des UMR CNRS 6097 (P Barbry), CNRS 6543 (F Pedeutour), CNRS 6543 (C Dani), CNRS 6543 (J Pouysségur) § Projet de l’Equipe CEA-UNSA (T Pourcher) • Projets Nationaux: § CEA Saclay (S Chevillard) § PHRC 2004 (Grenoble, Lyon, Nancy, Nice/E Brambilla-F Thivolet-JM Vignaud)(CHUN, P Hofman) § PNES Cancer du Poumon INCa 2006 (3 projets) § PHRC Campagne 2007 (IGR, Ph Viehl) § PHRC Campagne 2007 (CHUN, P Hofman)

Biobanking Department of Medicine LOCAL Pathology Lab (Nice) Department of Surgery Central Biobank Department of Informatic and Public Health NATIONAL Uncertain diagnosis: Systematic slide/case relecture INSERM ERI-21 Faculty of Medicine Recording data Clinical data Histological data Images Number and sites of biopsies Quantity of frozen tissue available

INCa European Biobanking Network Marseille Cancéropôle PACA INSERM CNRS Tissue Bank Nice Industrials

Tumoral and non Tumoral Lesions Patient Consent Frozen specimen Tumoral/ non tumoral Reseach Clinical datas Treatment Outcome Controls Images RNA Quantity/Quality Gross macroscopy Histology Paraffin Blocks « in mirror » « in mirror Pathology DNA arrays RNG Central database Cresalys Tissue microarrays automatisation quantification

CRB INSERM-Justification de la demande • Mise à disposition pour la recherche de produits biologiques dérivés sur les collections ciblées tumorales et non tumorales : § Plasmathèque, sérothèque § ARN thèque, ADN constitutionnel § Lignées primaires épithéliales • Elargissement à des pathologies non tumorales très ciblées (pathologie auto-immune de la thyroïde) • « Optimisation » de l’assurance-qualité (ISO 9001) • Ingénieur qualité (50% ETP), Technicien (50%ETP), Secrétariat (20%ETP) sur 3 ans