UE 1 Radicaux libres Stress oxydant gense et

UE 1 Radicaux libres, Stress oxydant : genèse et détoxification 2019 -2020 K Peoc’h Département de Biochimie BCH BJN 1

Objectifs • Citer les principaux acteurs du stress oxydant • Définir un radical libre • Décrire l’origine de ces marqueurs • Citer les principales cibles des espèces réactives • Citer différentes pathologies impliquant le stress oxydant • Citer les principales méthodes d’exploration 2

PLAN 1. Stress Oxydant : Origine et Définition 2. Espèces réactives de l’oxygène ou ROS 1. Description 2. Principaux modes de production 3. Impact en physiopathologie 4. Mécanismes de protection 5. Exploration 3

STRESS OXYDANT : ORIGINE ET DÉFINITION 4

Anoxie mortelle à court terme chez les aérobies • Chute de l’ATP cellulaire ->Mort tissulaire • Cerveau détruit en 3 minutes • Foie, rein et myocarde en qq heures • Muscle, peau et phanères, bcp plus tard 5

Que se passe t-il au sein de nos cellules ? Oxygène nécessaire au transfert d’ecouplé aux phosphorylations oxydatives : source principale d’énergie Fuites au niveau mitochondrial Cellules aérobies produisent des réactives de l’oxygène, neutralisées antioxydants espèces par les 6

Balance 7

Stress oxydant UV, rad. ionisantes Xénobiotiques Inflammation ANTIOXYDAN TS LIPIDES PROTEINES Vit E, Vit C Se, Cu PROOXYDANTS Oxydation GSH (paracétamol) ERO ERN Oxydation ADN Déséquilibre de la balance pro-oxydants/antioxydants Dommages oxydatifs des biomolécules Helmut Sies (1985) 8

ROS et défense contre les micro-organismes • Globules blancs : utilisent l’O 2 pour tuer les bactéries phagocytées (via NADPH oxydase, i. NOS) • Monocytes et polynucléaires neutrophiles : mécanisme spécifique pour créer des radicaux libres oxygénés • Rôle de la NADPH oxydase • Rôle de la Myeloperoxydase 9

NO et transduction du signal • (. NO) : radical libre issu de l’oxydation enzymatique du noyau guanidinium de l’arginine en présence d’oxygène et de NADPH, par NO synthase • Signal diffusible: diffusion inter-cellulaire • NO synthases: • constitutive dépendante du Calcium (second messager) • inductible 10

NO Active les guanylyl-cyclases cytoplasmiques ->Relâchement des cellules musculaires lisses : vasodilatation, hypotension, . . . Prodrogue 11

NO°et modifications post-traductionnelles • Nitrosylation et S -nitrosylation 12

Effets cellulaires des ERO et ERN fonction de leur concentration Red Oxydations réversibles Oxydations irréversibles Ox Signalisation Redox SO Croissance Différentiation Prolifération Adaptation Apoptose Nécrose Mort cellulaire 13

Adaptation cellulaire au stress oxydant Induction de gènes Stress oxydant Toxicité: ADN, ARN Protéines Lipides Adaptation Enzymes anti-oxydantes et de réparation Enzymes Répression productrices de gènes ERO 14

Mise en évidence de l’adaptation Hormésie : réponse biologique favorable en réponse à l’exposition à de faibles doses de toxiques 24 h Cellules + H 2 O 2 1 m. M Mort cellulaire 24 h Cellules + H 2 O 2 100 n. M 24 h H 2 O 2 1 m. M Survie cellulaire 15

Rôle dans la signalisation cellulaire -Modification réversible des groupements thiols des cystéines des protéines -Rôle de messagers secondaires H 2 O 2 NO 16

Modifications réversibles des cystéines réactives des protéines disulfure TRX GSH H 2 O 2 - Thiolate S-glutathionylation H 2 O 2 NO TRX GRX SO 3 H SRX Acide sulfénique Acide sulfonique Acide sulfinique S nitrosylation D’après Y. M. W. Janssen-Heininger. et al (2008) 17

Protéines cibles des oxydations réversibles des cystéines Phosphatases : Inactivées Kinases : activées ou inactivées Protéases : activées ou inactivées Caspases (Inhibition par H 2 O 2 et NO) Métalloprotéinases (activées par H 2 O 2 et NO) Régulation des facteurs de Transcription NK B activé par H 2 O 2, inactivé par NO 18

Mécanisme de l’adaptation par une élévation modérée des ERO et ERN inducteurs O 2 -. peroxydases H 2 O 2 , NO • Radiations, • Exercise physique (entraînement) • Préconditionnement ischémique Thiols Oxydation réversibles des Réductases cystéines (Tr. X, Gr. X) Modifications phosphatases, transcription) Signalisation cellulaire d’activité (kinases, facteurs de Expression de gènes Enzymes antioxydantes (adaptation) 19

Effets cellulaires des ERO et ERN Red oxydations réversibles oxydations irréversibles Ox Signalisation red ox SO Croissance Différentiation Prolifération Adaptation Apoptose Nécrose mort cellulaire 20

Méfaits des ERO et ERN • Stimulés par les radiations ionisantes • Entrainnent : • • • Mutations de l’ADN Peroxydation lipidiques Altération des protéines Anomalies de la transduction des signaux Modulent les gènes et les protéines de stress régulant prolifération, différenciation cellulaire et apoptose 21

Toxicité • ADN: génotoxicité ->Mutagenèse • ARN: oxydation et altération • Lipides: peroxydation, toxicité des produits oxydés, -> anomalie signalisation, athérosclérose ? • Protéines: oxydation des acides aminés (Cys, Met…) Nitrosylation (NO), Carbonylation dénaturation (protéines chaperones), - > agrégation, maladies dégénératives ? • Glucides: glycation et dérivés ->Diabète 22

Cibles Moléculaires ADN - Quelques exemples de dérivés d’oxydation des bases de l’ADN par les ROS. Peuvent induire des mutations par mésappariement (8 -OH hydroxy guanine – A) ou la mort cellu 23

Cibles Moléculaires : Lipides Acide arachidonique Exemples d’effets des ROS sur les lipides: formation de l’isoprostane Composé Prostaglandinelike 24

Cibles Moléculaires : Lipides - Oxydation des lipides par les ROS Aldéhydes dérivés d’acides gras polyinsaturés Dérivés du cholestérol: oxystérols 25

Cibles Moléculaires : Protéines Dérivés d’acides aminés Les modifications des protéines peuvent induire des altérations fonctionnelles 26

ESPÈCES RÉACTIVES DE L’OXYGÈNE OU ROS 27

Acteurs du Stress Oxydant: Espèces Réactives de l’Oxygène (et de l’Azote) ESPECES RADICALAIRES Radical hydroxyle Anion superoxyde O 2 . Radicaux lipidique. s OH LO° alcoxyle LOO° peroxyle LO. Monoxyde d’azote. LOO NO -. O 2 ONO 2 peroxynitrite H 2 O 2 Peroxyde d’hydrogène ESPECES NON HOCl Acide hypochloreux 28

Radicaux libres (RL) "Radical libre" (RL) =espèce chimique - électron non apparié - Existence indépendante ('libre') 1/ R. 2/ électriquement neutres ou chargés : radicaux cationiques r. + et anioniques R. 3/ réactivité particulière avec d’autres atomes ou molécules 4/ oxydant ou réducteur 29

Formes réactives de l'oxygène (ROS) Formes radicalaires (RLO) Formes non radicalaires __________________________ Superoxyde O°Peroxyde d'hydrogène H 2 O 2 Hydroxyle OH° Acide hypochloreux HOCl Peroxyle ROO° Ozone O 3 Alkoxyle RO° Oxygène singulet 1 Dg Aydroperoxyle HOO° Peroxynitrite ONOO__________________________ 30

Origines 2 grandes voies de production Transfert d’électrons O 2 + e- O 2 -. Lié au métabolisme cellulaire 31

Réduction progressive de l’oxygène O 2 1 e -. 4 e- O 2 (anion superoxyde) 1 e - Dismutation O 2 -. H 2 O 2 (peroxyde d’hydrogène) 1 e Fenton Fe 2+ OH˙ (radical hydroxyle) 1 e H 2 O 32

Formation des EOR Cyclo-oxygénases Lipo-oxygénases Echappement chaîne respiratoire 33

Métabolisme et localisation EROs sont des produits 2 aires du métabolisme Mitochondrie (respiration cellulaire) O 2 - 34

Fuites d’électrons au cours de la respiration cellulaire H+ H+ H+ UQ MATRICE e- NADH FADH 2 e- O 2 - 5% O 2 2 H 2 O ADP + H+ Pi ATP membrane interne Membrane externe Essential of Cell Biology » - Alberts et al - Ed. Garland 35

Production des Espèces Réactives de l’Oxygène et de l’Azote au cours du métabolisme EROs : produits 2 aires du métabolisme Mitochondrie (respiration cellulaire) EROs et ERNs : produits par des enzymes spécifiques O 2 - Nox NADPH oxydases Xanthine oxydase (catabolisme des bases puriques) Cyclooxygénase Lipoxygénases (Synthèse des PGs et LOOH) Cytochrome P 450 (métabolisme des xénobiotiques) 36

NADPH Oxydase (Nox-2) des phagocytes Rôle majeur dans l’inflammation et dans l’immunité innée NADPH NADP+ Nox-2 O 2 Explosion respiratoire O 2 -. H 2 O 2. OH Defense contre les microorganismes 37

Principales Nox et physiopathologies Fonctions Physiopathologies Phagocytes Cell endothéliales Cardiomyocytes Muscle squelettique Fibroblastes Microglie, neurones Défense Granulomatose Maladies Cardio. Vasc. Neurodégénérescence Angiogénèse Carcinome prostatique Nox-1 Cell. Muscle lisse Cell epithéliales Défense Différentiation Athérogénèse Maladies Cardio-. Vasc. Nox-3 Oreille interne Sénescence Octoconies Nox-4 Cell. Muscle lisse Cell endothéliales Fibroblastes Signalisation cellulaire Apoptose Nox-5 Macrophages Lymphocytes Athérogénèse Maladies Cardio- Vasc Neurodégénerescence Angiogénèse, Diabète Différentiation Infertilé masculine Duox-1 et 2 Cell épithéliales (thyroïde, poumon) Défense Hormone Types de Nox-2 Constitutive Produisent H 2 O 2 Distribution Hypothyroïdisme 38

Production des Espèces Réactives de l’Oxygène et de l’Azote au cours du métabolisme EROs sont des produits 2 aires du métabolisme Mitochondrie (respiration cellulaire) Xanthine oxydase (catabolisme des bases puriques) EROs et ERNs sont produits par des enzymes spécifiques des types cellumaires O 2 - NO ONOO- Nox NADPH oxydases NO synthases Cyclooxygénase Lipoxygénases (Synthèse des PGs et LOOH) Cytochrome P 450 (métabolisme des xénobiotiques) 39

NO Synthase inductible des phagocytes Rôle majeur dans l’inflammation Arginine NADPH i NOS NO O 2 NADP+ Nox-2 O 2 -. Citrulline Nox-2 O 2 NO O 2 -. ONOO- H 2 O 2. OH 40

Production des Espèces Réactives de l’Oxygène et de l’Azote au cours du métabolisme EROs sont des produits 2 aires du métabolisme Mitochondrie (respiration cellulaire) Xanthine oxydase (catabolisme des bases puriques) Cyclooxygénase Lipoxygénases (Synthèse des PGs et LOOH) Cytochrome P 450 (métabolisme des xénobiotiques) EROs et ERNs sont produits par des enzymes spécifiques O 2 - NO ONOO- H 2 O 2 Cl- F 2+ + Cu e . OH Nox NADPH oxydases NO synthases Myélo peroxydase HOCL 41

Myéloperoxydase des neutrophiles: défense et inflammation Arginine i NOS NADPH NO O 2 NADP+ Nox-2 citrulline O 2 -. O 2 H 2 O 2 + Cl. OH MPO NO O 2 -. ONOO- HOCL +OH- Neutrophile 42

2 grandes voies de production Transfert d’électrons O 2 + e- O 2 -. Lié au métabolisme cellulaire Scission homolytique des liaisons covalentes A. . B A. + B. Nécéssite de l’énergie 43

Radiations ionisantes . OH Radiolyse de l’eau H 2 O irradiation . OH + H+ + e-aq ionisation excitation. OH + H. 44

UV lumière . OH O 2 -. Lumière 1 O 2 Photolyse H 2 O 2 UV 2. OH Photochimie h S* S 3 O 2 transfert flavines quinones d’énergie transfert d’e porphyrines chlorophylles 1 O 2 -. 45

Facteurs augmentant la production ERO et ERN Facteurs environnementaux Radiations Ionisantes, UV Médicaments, Pesticides, Solvants industriels Métaux lourds Surcharge Fe, Cu ERO, ERN Polluants atmosphérique s Infections Hyperglycémie Hyperlipidémie Ischémie/ reperfusion Inflammation Facteurs endogènes 46

IMPACT EN PHYSIOPATHOLOGIE 47

Etats pathologiques impliquant le stress oxydant Cause ou Conséquence? Pathologies chroniques • Athérosclérose • Cancer • Diabète • Cataracte, DMLA • Maladie d’Alzheimer • Vieillissement Pathologies aiguës • Lésions de reperfusion post-ischémique (infarctus, AVC, greffe d’organes) • Hyperoxygénation (O 2 hyperbare) • Choc septique • Inflammation 48

Etats pathologiques impliquant le stress oxydant Cause ou Conséquence Pathologies chroniques • Athérosclérose • Cancer • Diabète • Cataracte, DMLA • Maladie d’Alzheimer • Vieillissement Pathologies aiguës • Lésions de reperfusion post-ischémique (infarctus, AVC, greffe d’organes) • Hyperoxygénation (O 2 hyperbare) • Choc septique • Inflammation 49

Oxydation des LDL dans l’initiation de l’athérosclérose MCP 1 ERO mm. LDL ERO Heinecke J W J Exp Med 2006; 203: 813 -816 50

Différentes formes de LDL oxydées LOOH Native seeded Extensively oxidized Minimally oxidized -NHX Oxidatively modified 51

Facteurs de risques de la maladie coronarienne et concentration d’isoprostanes Isoprostanes Facteurs de risques (plasma, urine) Fumeurs X 3 gros fumeurs Hypercholestérolémie X 2à 3 Diabète type 2 X 2à 6 Obésité X 3 à 4 - log iso. P urinaire corrélé Hypertension X 2 - log iso. P urinaire corrélé Protéine C réactive X 1. 5 (homocystéine élevée) au IMC avec la pression systolique D’après Davies s. & Roberts 52, 2011

Etats pathologiques impliquant le stress oxydant Cause ou Conséquence Pathologies chroniques • Athérosclérose • Cancer • Diabète • Cataracte, DMLA • Maladie d’Alzheimer • Vieillissement Pathologies aiguës • Lésions d’ischémie/reperfusion (infarctus, AVC, greffe d’organes) • Hyperoxygénation (O 2 hyperbare) • Choc septique • Inflammation 53

Chaine respiratoire NADH Deshydrogénase Succinate Deshydrogénase Cytochrome C Réductase Cytochrome C Oxydase ME FADH 2 MI 54

Désynchronisation de la chaîne respiratoire durant l’ischémie reperfusion Ischémie: découplage avec excès e- et anoxie e- e. I II IV V ANT ATP->ADP->AMP ---- Adénosine->Hypoxanthine Induction de Xantine oxydase ->Anion superoxyde à la reperfusion 55

Modifications de la chaîne respiratoire durant l’ischémie reperfusion (2) Reperfusion: apport massif O 2 sur les e- accumulés Mn. SOD O 2 I H 2 O 2 O 2º- º- II IV V ANT 56

Mécanismes lésionnels et initiation de la réponse inflammatoire au cours des phases précoce et tardive de la reperfusion (d’après Jaeschke, 2003 CE : cellules endothéliales ; ERO : espèces réactives de l’oxygène ; IL-1 : interleukine-1 ; PNN : polynucléaires neutrophiles ; TNF-α: Tu m o r N e c r o s i s Fa c t o r α 57

Cytochrome P 450 du réticulum endoplasmique Reaction de mono-oxygenation: A-H + O 2 + NADPH, H+ A-OH + H 2 O + NADP+ RE riche en cytochromes P 450 impliqués dans les processus de métabolisme des Xénobiotiques Rôle de l’exposition aux médicaments et toxiques 58

Génèse ERO via CYP 450 Fe. III P 450 –Fe. III-SH 2 e. O 2 NADPHCyt. P 450 reductase P 450 -Fe. III-SH SOH O 22 P 450 -Fe. III-SH + O 2 - et/ou H 2 O 2 59

Robin, 200560

MÉCANISMES DE PROTECTION 61

Stress oxydant: adaptation et défense 1ère ligne Molécules anti-oxydantes: GSH, Vit C, Vit E, biliverdine, Ac urique, Hème …. 2ème ligne Induction ou répression des gènes Activités enzymatiques anti-oxydantes: GPx, Cat, SOD, Hox… Activités enzymatiques pro-oxydantes: CYP, oxydases… Réparation: ADN, protéines (Trx, Trx réductase, chaperon) Dernière ligne Apoptose 62

Apports alimentaires 63

Protections contre le stress oxydant Confinement en organelles Protections non spécifiques Protections spécifiques 64

Origine subcellulaire Mitochondries : principale source de production de radicaux libres Mitochondries Microsome Peroxysome 20% 30% Cytosol 45% 5% Exception pour le foie: microsomes Mitochondries Microsome Peroxysome Cytosol 15% 5% 45% 35% 65

Confinement en organelles • Mitochondrie • COX, certaines oxydases • Sensibilité de l’ADN mitochondrial • Peroxysomes • Contiennent de nombreuses oxydases • Catalases et peroxydases 66

Rôles des peroxysomes • Métabolisme des peroxydes, des ERO et ERN • Synthèse des plasmalogènes • b- et a-oxydation des acides gras • Métabolisme du glyoxylate • Métabolisme des acides aminés (dégradation des isomères D des acides aminés, catabolisme de la L-lysine, dégradation des polyamines) 67

Enzymes de défense antioxydante inhibition Enzymes clées (Housekeeping enzymes) Superoxyde dismutases Catalase Glutathion peroxydases SOD O- 2 CAT H 2 O 2 H 2 O GPx, GSH LOOH ONOO- LOH NO 2 - 68

Systèmes enzymatiques de défense O 2. - Superoxide dismutases (Cu/Zn-Mn) Fe 2+ Fe 3+ H 2 O 2 Catalase H 2 O + O 2 . OH GSH-Peroxidase GSH GSSG H 2 O 69

Autres protéines antioxydantes Protéines enzymatiques -Thiols-disulfures oxydoréductases et transférases - Système thiorédoxine (thiorédoxine/thiorédoxine réductase/NADPH) - Peroxirédoxines (thiorédoxine peroxydases) - Système glutarédoxine (glutarédoxine/ glutarédoxine réductase/GSH) - Hème oxygénase Protéines non enzymatiques -Sequestrants des minéraux - Fe: Transferrine, ferritine, lactoferrine - Cu: céruloplasmine, albumine - Métallothionéines: Zn+, Cu+, Cd+, Hg 2+ 70

Antioxydants de bas poids moléculaire Endogènes - glutathion (synthèse via N-acétyl cystéine) - acide urique : 1 O 2, LOO° - bilirubine : 1 O 2, LOO° - acide lipoïque : . OH, LOO°, HOCL, ONOOH - coenzyme Q 10 : LOO° Apportés par l’alimentation - Vitamines E et C - Caroténoïdes - Polyphénols, flavonoïdes 71

Glutathion • Tripeptide (glycine, glutamate, cystéine) • Dans toutes les cellules à des concentrations élevées • Forme réduite: groupement –SH • Forme oxydée: 2 tripeptides se lient de manière covalente (S-S, pont disulfure) • 2 atomes d ’H libérés: H 2 O 2 --> 2 H 20 72

La forme réduite (GSH) maintient l’état réduit normal de la cellule Forme Réduite (GSH) 73

Intoxication au paracétamol Traitement : N-Acétyl cysteine Favorise la restauration du stock de glutathion 74

En aval : réparation non spécifique Réparation des lipides oxydés Excision des bases oxydées Réparation des protéines oxydées insuli 75

Vitamines antioxydantes • Rôle biologique essentiel • Vitamines hydrophiles • Acide ascorbique (vitamine C) • Vitamines liposolubles • Vitamines A & E 76

Techniques d’exploration Isoprostanes dérivés de la famille des prostacyclines les Isoprostanes, dont la 8 -epi PGF 2 alpha Peroxydation de l’acide arachidonique , indépendante de l’action des enzymes cyclooxygénase et lipooxygénase Hydroperoxydes lipidiques Aldéhydes stables comme le Malondialdéhyde (MDA) et les 4 hydroxyalkenals comme le 4 HNE (4 hydroxynonenal) Glutathion : Stress oxydant rapport glutathion réduit/glutathion oxydé Dosage des défenses: acide ascorbique, a-tocophérol, b-carotène, ubiquinol, … 77

Techniques d’exploration Total antioxydant status mesure la capacité totale antioxydante du plasma Marqueurs de la peroxydation des protéines Protein adducts on protéines carbonylées. Marqueurs de la peroxydation des acides nucléiques 8 -0 H-deoxyguanosine. Marqueurs de l’activation des PN Dosage de la myeloperoxydase, de la Lactoferrine et de l’elastase. Dosages d’enzymes anti oxydantes la SODs, la Glutathion peroxydase selenium dept ou indept, la catalase. 78

Stress oxydant : nouvelle définition ANTIOXYDANTS PRO-OXYDANTS Oxydation LIPIDES ERO ERN ADN Nitrosylation nitration PROTEINES Déséquilibre de la balance pro-oxydants/antioxydants domages oxydatifs des biomolécules Helmut Sies (1985) Perturbation de la signalisation et du contrôle de l’homéostasie redox (Dean Jones 2006) Pr. J. Cillard, Pharmacie, Rennes 79

Conclusion -Homéostasie redox : équilibre entre production d’espèces réactives et lutte contre ces espèces -Impact positif dans la défense anti-microbienne -Rôle du stress oxydant dans la signalisation et l’adaptation cellulaire -Impact en physiopathologie : cause ou conséquence? 80

Take home message • Espèces radicalaires de l’oxygène et de l’azote : • Role physiologique • Role pathologique • Importance d’un équilibre redox, sinon induction d’un stress oxydant • Important arsenal de protection : spécifique (Enzymatique+++) et aspécifique • Peu exploré en pratique clinique quotidienne 81

Pour aller plus loin • C Migdal et M Serres, Espèces réactives de l’oxygène et stress oxydant, 2011, Med. Sci. • S. Benhabbouche et al, Base des phénomènes d’ischémie reperfusion et de la protection myocardique, Annales Françaises d’Anesthésie et de Réanimation 30 (2011) 82