Twist DX ProbePrimer 2018 05 07 Twist AmpAmp
Twist DX Probe&Primerの選定方法 2018. 05. 07
Twist. Amp®Amp Probe作成 【作成条件】 u 2つのチミジンが約6 bp未満のヌクレオチドを挟んで認められる部位 u テトラヒドロフラン(H)から5’側に 30 bp以上 u テトラヒドロフラン(H)から3’側に 15 bp以上 u フルオロフォアやクエンチャーとHの間は 0塩基、1塩基、2塩基でも良い。 F =内部d. T-FAM(フルオロフォア) H =THF(テトラヒドロフラン残基) Q =内部d. T-BHQ 1(クエンチャー) Twist. DX RPAプライマーとプローブに関するガイドラインより引用 5’―TCACCCACACTGTGCCCATCTACGAGGGGTATGCCCTCCC CCATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGGCCGGGACCTGACTACCTCATGAAGATCCTCACCGAGCGCGGCTACAGCTTCA 30 bp CCACCACGGCCGAGCGGGAAATCGTGACATTAAGGAGAA FH Q 15 bp GCTGTGCTACGTCGCCCTGGACTTCGAGCAAGAGATGGCCACG GCTGCTTCCAGCTCCTCCCTGGAGAAGAGCTACGAGCTGCCTG ACGGCCAGGTCATCACCATTGGCAATGAGCGGTTCCGCTG― 3’
候補Primerからの選定 >ACTB_F 1 CCTCACCGAGCGCGGCTACAGCTTCACCAC >ACTB_NGR 1 TTGCTCGAAGTCCAGGGCGACGTAGCACAG Forward. PrimerとReverse. Primerを入力して Submitを押すと、入力したPrimer. PairでのPCR配 列が全て表示されます。 このPrimer. Pairでは3つのAmpliconが出て きてしまうので、特異的とは言えない。 次のPrimer. Pairの候補を探し、In-silico=1 になるものを探す。
>ACTB_F 1 CCTCACCGAGCGCGGCTACAGCTTCACCAC >ACTB_R 1 AGCCGTGGCCATCTCTTGCTCGAAGTCCAG In-silico=1 このように、候補PrimerからIn-silico=1になるようなPrimerを選んでいく。
作成したPrimer&Probe FPrimerはProbeから5’方向に 30 bpで設定。 RPrimerはProbeに被ってはいけない。 【 In-Silico結果】 F 1 F 2 F 3 F 4 F 5 F 6 F 7 F 14 F 15 F 16 NGR 1 3 2 1 1 1 3 3 2 2 1 NGR 2 3 2 1 1 1 3 3 2 2 1 これができるのはGenome データベースにあるものだけ NGR 3 3 3 1 1 1 5 5 2 2 1 R 1 1 1 R 2 1 1 1 1 1 R 3 1 1 1 1 1 R 4 1 1 1 1 1 R 5 1 1 1 1 1 R 6 2 1 1 1 6 7 7 1 6 1 R 7 2 1 1 2 2 1 1 1 【Amplicon Size】 F 1 F 2 F 3 F 4 F 5 F 6 F 7 F 14 F 15 F 16 NGR 1 110 115 120 NGR 2 115 120 125 272 NGR 3 120 125 130 277 282 R 1 115 120 125 130 135 140 145 195 226 287 R 2 120 125 130 135 140 145 150 200 231 292 R 3 125 130 135 140 145 150 155 205 236 297 R 4 130 135 140 145 150 155 160 210 241 302 R 5 135 140 145 150 155 160 165 215 246 307 R 6 170 175 180 245 337 R 7 208 213 218 223 283 314 375
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