TUBERCOLOSI La tubercolosi uninfezione causata da due specie

TUBERCOLOSI La tubercolosi è un’infezione causata da due specie di micobatteri: Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium bovis. Nonostante questi microorganismi possano infettare qualsiasi organo, in pratica è di gran lunga preminente la localizzazione polmonare, caratterizzata istologicamente dalla formazione del tipico granuloma. 1

MICOBATTERI Bacilli molto sottili Immobili, non sporigeni, aerobi obbligati alcune specie producono forme filamentose con ramificazioni mico-batteri : simili ai funghi peculiari involucri esterni ricchi di lipidi difficilmente penetrabili dai coloranti e una volta colorati difficilmente decolorabili anche con l’uso di acidi acidoresistenza rallentamento negli scambi di nutrienti- rallentamento crescita (t. duplicazione 18 -24 h, colonie visibili in 3 -6 sett. ) 2

MICOBATTERI • Diverse specie innocui saprofiti nel suolo o commensali nell’uomo (M. smegmatis) • Mycobacterium tuberculosis complex: -M. tuberculosis (b. di Koch) tubercolosi umana -M. bovis tubercolosi bovina, trasmissibile all’uomo -M. africanum, M. canetti tubercolosi umana MOTT: (Mycobacterium other than tuberculosis) micobatteri opportunisti, hanno assunto rilievo negli ultimi anni: una delle più frequenti cause di morte nel pz. malato di AIDS es. MAC (Mycobacterium avium complex) 3 • M. leprae lebbra

Classificazione dei principali micobatteri 4

M. tuberculosis epidemiologia • Tubercolosi: ogni anno alcuni milioni di nuovi casi • Mortalità: 2 -3 milioni/anno • patologia riemergente a causa di: - flussi migratori, nuove sacche di povertà anche in paesi industrializzati, aumento patologie da immunosoppressione Caratteri antigeni • 2 caratteri antigeni: di natura polisaccaridica e proteine citoplasmatiche • cere (acidi micolici + glicolipidi fenolici) con azione adiuvante l’immunogenicità dei 2 tipi di Ag favoriscono la risposta cellulo-mediata 5

PATOGENICITA’ Questo microorganismo non produce esotossine, quindi l’azione patogena sembra imputabile ad una sua tossicità intrinseca legata ad alcuni lipidi della parete cellulare presenti in grande quantità. Questi lipidi risultano essere in parte vere e proprie cere, in parte glicolipidi, questi ultimi denominati micosidi dei quali uno in particolare è considerato essere direttamente correlato con la virulenza: il fattore cordale. Un altro micoside di notevole importanza è la cera D, sostanza localizzata nello strato basale della parete formata da acidi micolici e da un glicopeptide. Ha il potere di aumentare l’immunogenicità 6

M. tuberculosis Glicolipidi fenolici cere 7

M. tuberculosis fattori di patogenicità produzione di emolisine e lipasi, ma non vere tossine Catalasi, perossidasi e lipoarabinomannani aiutano a resistere alla risposta cell-ossidativa capacità di resistere al killing intracellulare: -inibizione fusione fagosoma-lisosoma -inibizione acidificazione contenuto del fagolisosoma Acidi micolici + glicolipidi, cere D, trealoso 6, 6 dimicolato (fattore cordale) causano la formazione di granulomi nei tessuti animali fattore cordale tossico per i macrofagi 8

Patogenicità Le lesioni istopatologiche caratteristiche della malattia possono essere di tipo essudativo o produttivo. Le prime sono presenti nelle fasi iniziali del contagio o quando il microorganismo prolifera in carenza di risposta immune adeguata da parte dell’organismo infettato, mentre le seconde sono tipiche della fase in cui il soggetto infettato ha sviluppato una ipersensibilità alle proteine tubercolari. 9

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M. tuberculosis patogenesi • trasmesso per via aerogena si deposita negli spazi alveolari infiammazione essudativa e accumulo di macrofagi fagocitano micobatteri uccisione bacilli e presentazione antigene innesco risposta immune CD 4 CD 8 citotossico lisi e liberazione micobatteri macrofagi attivati fagocitosi e processo infiamm. di tipo granulomatoso tubercolo, circondato da connettivo e porzione centrale in necrosi, segue precipitazione di sali di calcio complesso primario 13

M. tuberculosis patogenesi sterilizzazione complesso primario infezione cronica paucibacillare asintomatica, che richiede macrofagi attivati, CD 4 e CD 8 diminuita efficienza del sistema immunitario riattivazione, moltiplicazione, lesioni granulomatose confluenti, necrosi e colliquazione della parte centrale contenuto in circolo e diffusione dell’infezione in sede polmonare ed extrapolmonare (tubercolosi miliare, meningea, renale, ossea)- espettorato + trasmissione ad altri individui • Rischio di riattivazione più grande entro 2 anni dalla infezione primaria 14

Diagnosi Primo passo nella diagnosi laboratoristica consiste nell’allestimento del preparato microscopico: strisci colorati con metodiche evidenzino l’alcool-acido resistenza tipica dei Micobatteri come la metodica di Ziehl-Neelsen La sensibilità dell’esame microscopico è purtroppo bassa e richiede perché sia positiva una carica di 10. 000 bacilli/ml, 15

Diagnosi La diagnosi definitiva si ottiene però tramite l’esame colturale ostacolato dall’esasperante lentezza di crescita dei micobatteri. Primo passo è la liquefazione e decontaminazione del campione, che solitamente viene eseguita utilizzando N acetil cisteina come mucolitico in soluzione con idrossido di sodio all’ 1%: quest’ultimo garantisce l’uccisione di tutti gli altri microorganismi, mentre i micobatteri risultano protetti grazie alla particolare ricchezza in acidi grassi. 16

M. tuberculosis diagnosi microbiologica ricerca microscopica • ricerca di bacilli acido-resistenti in espettorato, liquor, materiale bioptico, urine (possibilità di confondere con M. smegmatis saprofita dell’apparato genito-urinario) ricerca colturale il materiale deve essere decontaminato dalla popolazione microbica accessoria (NAC + Na. OH 2 -3% poi HCl)- incubazione 2 -3 settimane a 37°C colonie con leggera pigmentazione giallastra apparecchiature automatizzate: terreno liquido con palmitato(14 C) che viene metabolizzato dai micobatteri con liberazione di CO 2 17 radioattiva

Colorazione di Ziehl-Neelsen Organismo acidoresistente Organismo non acido-resistente Batteri sospesi in SF e fissati sul vetrino Carbol-fucsina e fenolo 3 min e sciacquare con H 2 O Decolorare con HCl 3% in alcool 70% 2 min e sciacquare con H 2 O Blu di metilene 30 sec sciacquare con H 2 O e asciugare 18

Colorazione di Ziehl-Neelsen 19

DIAGNOSI Per la ricerca di M. tuberculosis nell’espettorato si consiglia di raccogliere il campione del mattino per tre giorni consecutivi, mentre in presenza di una sospetta localizzazione alle vie urinarie sarà opportuno raccogliere la totalità di urine emesse nelle 72 ore. 20

MICOBATTERI terreni di coltura 3 tipi di terreni: • al tuorlo d’uovo (sorgente di lipidi) (IUTM, Lowenstein. Jensen), verde malachite, glicerolo (M. tubercolosis), piruvato (M. bovis) • a composizione chimica sol. tampone + acido oleico (sorgente di lipidi), albumina bovina, destrosio e catalasi (Middelbrook) • liquidi formazioni cordali: bacilli allineati in file parallele a causa della idrofobicità batterica 21

M. tuberculosis diagnosi microbiologica sonde molecolari amplificazione con PCR e ibridizzazione con sonde: identificazione definitiva a livello di specie (1 -2 gg) ricerca di anticorpi non affidabile Biologia molecolare anche per ricerca di antibioticoresistenza 22

M. tuberculosis reazione di Mantoux -tubercolina • • Utile a fini epidemiologici accerta la presenza di immunità-cellulo mediata tubercolina: proteine micobatteriche purificate si inietta tubercolina per via intradermica (0. 1 ml di opportuna concentrazione) nella faccia volare dell’avambraccio • è possibile anche utilizzare cerotti per l’assorbimento percutaneo • si osserva dopo 24 -48 h di incubazione allergia ritardata ( papula eritematosa) nei pz che hanno subito un’infezione reazione positiva • non ha senso diagnostico a meno che non si dimostri un passaggio da reazione negativa a positiva nello stesso soggetto in un breve periodo 23

M. tuberculosis reazione di Mantoux -tubercolina 24

M. tuberculosis Il test cutaneo alla tubercolina presenta problemi di scarsa sensibilità, la bassa specificità, il rischio di inadeguato follow-up del paziente per la lettura (esame standard per la diagnosi) Falsopositivi con micobatteri non-tubercolotici, vaccinazioni con il bacillo di Calmette-Guérin (BCG) (in particolare se recenti), errate interpretazioni soggettive Saggi basati sull’interferone gamma antigenespecifico individuano il rilascio di interferone gamma da parte di cellule T “di memoria” precedentemente sensibilizzate mediante stimolazione in vitro con proteine specifiche del M. tuberculosis. Questi esami non generano risultati falsopositivi in pazienti precedentemente vaccinati con BCG o affetti dalla maggior parte delle infezioni micobatteriche non-tubercolotiche; ciò consente una maggiore specificità dell’identificazione del M. tuberculosis. 25

Infezioni Latenti Circa un terzo della popolazione mondiale, compresi 11 milioni di pazienti negli Stati Uniti, presentano un’infezione latente da Mycobacterium tuberculosis. Pazienti provenienti da paesi in cui la malattia è endemica. Popolazioni economicamente svantaggiate e nei pazienti immunodepressi. Ritardi nell’individuazione e nel trattamento dell’infezione ne facilitano la trasmissione. Rilascio di interferone gamma e sull’amplificazione degli acidi nucleici consentono un’identificazione più rapida e specifica, rispettivamente, dell’infezione da M. tuberculosis 26 e della presenza di una malattia attiva.

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Resistenze e terapie La terapia della tubercolosi si protrae usualmente periodi molto lunghi (6 -9 mesi), questo perché le molecole utilizzate necessitano per agire di organismi metabolicamente attivi, mentre M. tuberculosis cresce molto lentamente. 29

Resistenze e terapie Nel paziente affetto da tubercolosi è verosimile suddividere i bacilli in tre differenti sottopopolazioni: • microorganismi che si sviluppano attivamente in ambiente extracellulare. • una seconda sottopopolazione intracellulare si riproduce più lentamente della precedente nel contesto della necrosi caseosa. • la terza, anch’esse a lenta crescita, si riproduce in ambiente intracellulare ed è quella presente all’interno dei macrofagi e dei monociti 30

Resistenze e terapie Non tutti i farmaci antitubercolari dimostrano la stessa efficacia nei confronti di queste tre sottopopolazioni, infatti isoniazide, streptomicina ed etambutolo risultano essere particolarmente attivi nei confronti delle popolazioni extracellulari metabolicamente attive; la rifampicina sembrerebbe attiva unicamente nei confronti della porzione di bacilli extracellulari. I micobatteri intracellulari sono invece sensibili alla pirazinamide che sperimentalmente si è dimostrata molto efficace 31

Meccanismo d’azione Isoniazide: inibizione sintesi ac micolici Rifampicina: RNA polimerasi Etambutolo: sintesi arabinofuranosilgalattosio componente della parete micobatterica. Pirazinamide abbassa il p. H citoplasmatico e disabilita alcuni sistemi di captazione attiva di nutrienti (quali basi pirimidiniche ed aminoacidi). 32

M. tuberculosis terapia iniziale: isoniazide 300 mg rifampicina 600 mg pirazinamide 2000 mg etambutolo 1200 mg giornalmente per 2 mesi terapia di mantenimento: isoniazide 600 mg rifampicina 600 mg 3 volte alla settimana per 4 mesi 33

Vaccinazione La vaccinazione contro la tubercolosi utilizzando vaccini preparati utilizzando vari ceppi dei bacilli di Calmette e Guèrin ha dato risultati controversi. Recenti studi hanno infatti dimostrato come il grado di protezione conferito possa variare notevolmente. Molto probabilmente la vaccinazione è utile nel prevenire le forme più aggressive evitando la disseminazione. 34

M. tuberculosis resistenza ai farmaci antitubercolari • emergono facilmente varianti farmaco-resistenti (necessità multi-terapia) • resistenza naturale: M. bovis e pirazinamide • resistenza acquisita: durante la replicazione batterica, le mutazioni avvengono con frequenza nota 10 -7 -10 -10 es. R alla rif 10 -8, R all’isoniazide 10 -6 Il trattamento con gli antibiotici favorisce la pressione selettiva, i ceppi possono accumulare più resistenze e una volta resistenti come tali possono essere trasmessi ad altri soggetti (R primaria il pz non è mai stato trattato con anti-tubercolari) la farmaco-resistenza è molto variabile nelle diverse aree geografiche 35

Best drug treatment for multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis José A Caminero, Giovanni Sotgiu, Alimuddin Zumla, Giovanni Battista Migliori Lancet Infect Dis 2010; 10: 621– 29 36

Best drug treatment for multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis José A Caminero, Giovanni Sotgiu, Alimuddin Zumla, Giovanni Battista Migliori Lancet Infect Dis 2010; 10: 621– 29 37

Nanotecnologie Per inviare ai macrofagi I farmaci direttamente Resa >3, 5 volte DDS, drug delivery systems 38

Nuovi antibiotici Delamanid (OPC-67683) is a novel mycolic acid biosynthesis inhibitor active against Mycobacterium tuberculosis Bedaquiline affects the proton pump for ATP synthase. This mechanism is unlike that of the quinolones, whose target is DNA gyrase. (on combination with moxifloxacin) PA-824 is a new chemical entity and a member of a class of compounds known as nitroimidazooxazines, with significant antituberculosis activity and a unique mechanism of action , nitroimidazopyrans inhibited the synthesis of protein and cell wall lipid. In contrast to current antitubercular drugs, nitroimidazopyrans exhibited bactericidal activity against both replicating and static M. tuberculosis. Lead compound PA-824 showed potent bactericidal activity against multidrug-resistant M. tuberculosis and promising oral activity in animal infection models. 39

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M. tuberculosis profilassi Isoniazide per 9 mesi o rifampicina per 4 mesi Il vaccino è costituito da una variante apatogena di M. bovis scoperta da Calmette e Guerin BCG inoculazione intracutanea Vaccinazione di massa non praticata nei paesi industrializzati vaccinazione di massa nei paesi in via di 42 sviluppo

M. leprae Bacillo di Hansen Si moltiplica nei macrofagi e nelle cellule di Schwann Lebbra: malattia cronica a lungo decorso (incubaz. 5 -7 anni) decorso caratterizzato da lesioni granulomatose cutanee o mucose (noduli leprosi) che vanno incontro a ulcerazioni provocando spesso mutilazioni deformanti LEBBRA LEPROMATOSA 43

M. leprae • Lebbra: caratterizzata da lesioni che coinvolgono varie terminazioni nervose periferiche con comparsa di vaste aree di ipoestesia e ipopigmentate LEBBRA TUBERCOLARE 44

M. leprae • Trasmissione interumana mediante inalazione o contatto diretto con le lesioni • Lebbra tubercolare: forte reazione cellulomediata (pochi bacilli nelle lesioni) • Lebbra lepromatosa: forte reazione anticorpale • Contagiosità: lebbra t. bassa Lebbra l. molto alta: numerosi bacilli nelle lesioni 45

M. leprae • Non coltivabile in vitro (armadillo e zampa di topo) • Diagnosi mediante dimostrazione dal reperto microscopico di bacilli acido-resistenti nei materiali provenienti dai granulomi cutanei o mucosi o test cutaneo specifico (forma tubercolare) 46

M. avium complex • Comune patogeno ambientale. Almeno 30 tipi: sierotipi 4 -8 infez. nei pz. AIDS, 11 -20 nei pz. non-AIDS • Trasmissione per inalazione o ingestione di H 2 O o cibo contaminati • Si lega e invade cellule oro-faringee e gastro-intestinali, sopravvive nei macrofagi • Causa: • 1 -tubercolosi polmonare in pz. Con funzione resp. compromessa (es. BPCO) o in pz. immunocompromessi • 2 - linfoadenite nei bambini • 3 -malattia disseminata nei pz. AIDS: febbre, sudorazione, perdita di peso, anoressia, dolore addominale, diarrea cronica, linfoadenite e polmonite, nessun organo è risparmiato. La massa dei bacilli replicanti compromette la funzionalità dell’organo • È la più comune micobatteriosi nei pz. AIDS • Trattamento: claritromicina + altri 2 farmaci (etambutolo, 47 rif. , cip. . ) isoniazide non attiva

I micobatteri devono il loro nome (una risposta): q. Alla struttura della parete x Alla loro forma q q. Al tipo di crescita q. Al tipo di metabolismo 48

L’alcool-acido resistenza dei micobatteri dipende (una risposta): x Dall’impermeabilità degli involucri esterni q q. Dalla permeabilità degli involucri esterni q. Dal tipo di crescita q. Dal metabolismo rallentato 49

Sono terreni per la coltivazione dei micobatteri (risposta multipla): x IUTM q q. Mc. Conkey q. Mueller Hinton x Middlebrook q 50

Quali delle seguenti affermazioni sono vere sulle formazioni cordali dei Micobatteri (risposte multiple): x Si formano nei terreni liquidi q q Si formano nei terreni solidi x Dipendono dall’idrofobicità batterica q x Sono formate da batteri q q Sono formate da materiale mucopolisaccaridico 51

Sono tutte caratteristiche dei micobatteri tranne una: q. Sono bacilli molto sottili q. Sono alcool-resistenti x Sono cocchi molto allungati q q. Crescono lentamente q. Crescono in terreni ricchi di lipidi 52

I micobatteri possono essere definiti (una risposta): q. Saprofiti q. Commensali q. Patogeni q. Opportunisti x Tutte le precedenti q 53

Sono tutti micobatteri tranne uno: q. M. smegmatis x M. influenzae q q. M. tubercolosis q. M. bovis q. M. leprae 54

Il termine Bacillo di Koch è sinonimo di (una risposta): x M. tubercolosis q q. M. avium q. M. bovis q. M. leprae q. M. smegmatis 55

La tubercolosi è una patologia (una risposta): q. Scomparsa in Europa x Riemergente in Europa q q. Molto diffusa in Europa 56

Contribuiscono ad aumentare l’incidenza della tubercolosi (risposta multipla): x Flussi migratori q x Terapie immunosopprimenti q x Denutrizione e condizioni igieniche scadenti q q. Uso degli antibiotici 57

Sono tutte caratteristiche delle cere tranne una: q Sono lipidi degli involucri esterni q Sono costituite da acidi micolici e glicolipidi fenolici q Coadiuvano l’azione immunogena degli antigeni q Stimolano la risposta cellulo-mediata x Conferiscono termo-resistenza q 58

Il principale fattore di virulenza di M. tubercolosis è (una risposta): q. La produzione di una potente tossina q. La produzione di enzimi idrolitici x La q capacità di resistere al killing intracellulare q. La capsula 59

Sono tutti fattori di virulenza di M. tubercolosis tranne uno: q. Emolisina q. Lipasi q. Fattore cordale x Invasina q 60

La tubercolosi si trasmette (una risposta): q. Per via oro-fecale q. Per via sessuale x Per via aerogena q q. Per via ematica 61

Quali cellule del sistema immunitario sono implicate nella patogenesi della tubercolosi (risposta multipla): x Linfociti TC q D 4 x Macrofagi q x Linfociti TC q D 8 q. Linfociti B 62

Il complesso primario è (una risposta): q. Il primo micobatterio che instaura l’infezione q. Il primo alveolo polmonare infettato x Un tubercolo con sali di calcio precipitati q 63

Sono materiali utili per la ricerca di M. tubercolosis tutti tranne uno: q. Espettorato q. Liquor q. Materiale bioptico q. Urine x Feci q 64

La diagnosi microbiologica di M. tubercolosis può essere di tipo (risposta multipla): x Microscopica q x Colturale q q. Ricerca anticorpi x Ricerca acidi nucleici q 65

Queste caratteristiche della reazione di Mantoux sono tutte vere tranne una: qÈ utile a fini epidemiologici q. Si esegue con proteine micobatteriche purificate q. Si ha reazione positiva nei pazienti che hanno subito un’infezione x È sempre utile a fini diagnostici q 66

Contro M. tubercolosis si usa una multiterapia perché (una risposta): q. L’infezione è spesso polimicrobica x Emergono facilmente varianti resistenti q q. Occorrono dosi massicce di antibiotico q. Non si conoscono i tassi di resistenza alle varie molecole 67

Tutte le affermazioni seguenti sulla terapia sono vere tranne una: q. La terapia iniziale è giornaliera q. La terapia iniziale dura 2 mesi x La terapia iniziale dura 4 mesi q q. La terapia di mantenimento è Isoniazide e Rifamicina 68