Trypanosoma cruci Trypanosoma brucei EXPRESIN EN TRIPANOSOMTIDOS Vernica

Trypanosoma cruci Trypanosoma brucei EXPRESIÓN EN TRIPANOSOMÁTIDOS Verónica Fernández Mancebo 2013 vfernan@fq. edu. uy Leishmania major Leishmania mexicana

Trypanosoma brucei

Organización del genoma nuclear L. major: 32. 8 Mb en 36 cr peq. (0. 28 -2. 8 Mb) T. brucei: 26 Mb en 11 cr grandes T. cruci: 60. 3 Mb en 41 cr peq Organizado en grandes grupos de genes policistrónicos (PGCs) (10 a cientos de genes codifican proteínas en la misma hebra)

32 53 Repetidos GGGTTA Repetidos ¿Promotor? ¿Otras seq? Codif. para ARNt ó ARNr Organización policistrónica

Inicio de la transcripción ARN polimerasas nucleares • 3 ARN polimerasas nucleares (I, II y III) • Transcripción policistrónica (genes no relacionados func. ) SUBUNIDADES ARNpol II 12, ARNpol I 14, ARNpol III 17 5 subun son compartidas entre las 3 2 subun son compartidas entre I y III con homólogas en la II 5 subun homólogas entre las 3 5 subun son específicas de III 2 subun son específicas de I Diferencias con eucariotas superiores: Existen varias copias para algunas de las subunidades El CTD de la pol II no contiene los repetidos 7 -pept característicos de eucariotas superiores

Inicio de la transcripción Factores de transcripción Se han identificado muy pocos Algunos muestran clara identidad de seq con los ortólogos en levaduras y vertebrados Otros presentan muy baja identidad Para ARN-pol II: TRF 4 (ortólogo div de TFIIB); SNAPc (SNAP 50+SNAP 2+SNAP 3); TFIIA; TFIIH (9 sub); complejo PBP 2 Para ARN-pol III: TFIIIB (2 subunidades) Para ARN-pol I: CITFA (específico para tripanosomátidos)

• Factor universal de transcripción relacionado con TBP (TRF 4: TBP related factor 4) Copyright © 2004, American Society for Microbiology Mol Cell Biol. 2004 November; 24(21): 9610– 9618. doi: 10. 1128/MCB. 24. 21. 9610 -9618. 2004. Functional Characterization of a Trypanosoma brucei TATA-Binding Protein. Related Factor Points to a Universal Regulator of Transcription in Trypanosomes Jia-peng Ruan, 1 George K. Arhin, 2 Elisabetta Ullu, 2, 3 and Christian Tschudi 1, 2* Departments of Epidemiology and Public Health 1 Internal Medicine 2 Cell Biology, Yale University Medical School, New Haven, Connecticut 3 *Corresponding author. Mailing address: Department of Epidemiology and Public Health, Yale University Medical School, 295 Congress Ave. , New Haven, CT 06536 -0812. Phone: (203) 785 -7332. Fax: (203) 785 -7329. E-mail: christian. tschudi@yale. edu. Received 2004 May 16; Revised 2004 July 19; Accepted 2004 August 13. TRF-4 y SNAP 50 Rol esencial en ARN pol I, II y III No necesariamente se unen en la región promotora, pero son importante en la transcripción de los genes: PARP, SL, U-sn. RNA

Finalización de la transcripción Para ARN-pol II: Tract de 6 o más “T” en 3’ del SL (similar a pol III) está involucrado en la finalización de la transcripción, pero no en la transcripción de genes de proteínas (¿diferencia en los complejos que transcriben? ) En PGCs convergentes se separan por varios ARNt ¿la transcripción termina dentro de los genes de ARNt? ¿estructura de la cromatina importa en la finalización de la transcripción? Para la ARN-pol III: Finaliza en varias Ts en el 3’ (nº variable en cada ARNt). No se ha identificado alguna proteína involucrada Para la ARN-pol I: Finaliza en el 3’, en área conteniendo secuencias cortas con potencial de formar un loop (similar a bacteria indep de rho) En genes de PRO: 3 elementos de secuencias en el 3’ que actúan sinergisticamente en una manera dependiente de la orientación

ARN polimerasa II • Es responsable de la transcripción de genes estruct (act, tubulina), de los genes del miniexon (ARN-ME o SLRNA) y otros sno. ARN • No parece existir promotores clásicos de eucariotas • Expresión constitutiva sin gran regulación en el inicio de la transcripción (similar a los TATA-less de eucariotas superiores) • Sin intrones (excep Poli(A) polim. de T. brucei, T. cruzi) • Transcripción policistrónica m. RNA maduro monocistrónico: capping, poli(A)

Promotor para ARN-pol II Tripartita Inr 100 pb Inr = CYAC/AYR(+1) -60 PBP 1 3 subunidades una TBP-like -30 I I Pol PBP 2 Inr Evidencia que recluta la pol II SL-RNA T. . . T

Qué se sabe sobre los pre-ARNm • Todos los genes de un PGC son transcriptos al mismo nivel como unidad policistrónica • Todos los ARNm maduros comienzan con la misma secuencia de 3040 nt -> miniexon (ME - SL) • Esa secuencia no se encuentra en las vecindades del gen que está siendo analizado • Existen 100 -200 genes para ME por núcleo en tandem • c/u está presente en un repetido de aprox 1, 3 kb • Su transcripto presenta Cap 4 (m 7 G, metilaciones 2’OH ribosas 1 -4 y metilaciones en las bases 1 y 4) y es monocistrónico

trans-splicing y poliadenilación están acoplados Generan ARNm maduro para ser exportado del núcleo

ARNm de las sintetasas de aminoacil-t. RNA

Si todos los genes del una PGC se transcribe en un mismo transcripto primario ¿por qué se tiene diferente concentración de las proteínas codificadas por esos genes? Incluso ¿diferente concentración de ARNm maduro?

Regulación de la expresión Transcripción constitutiva de genes para proteínas La principal regulación se da a nivel POST-TRANSCRIPCIONAL Elongación Regiones intergénicas (ME/poli(A)) Estabilidad ARNm (3’UTR) Traducción Estabilidad de la proteína • Esta regulación es la clave para los cambios en la expresión génica • Elementos en las regiones intergénicas (rol de las regiones UTR) 5’ UTR ME Reg. Cod. 3’ UTR AAAAA n

GP 82: gp de superficie presente en la forma infectiva y ausente en la sanguínea

3’UTR Destinos de los ARNm en tripanosomátidos (modelo) ORF CAP 4 5’UTR RBP

Promotor para ARN-pol III • Transcribe ARN pequeños (5 S, t. ARNs, 7 SL-ARN y todos sn. ARN) usando sn. ARN • Básicamente presenta los mismos promotores que eucariotas superiores: estar tanto en la región 3’ como 5’ TSS/Inr Punto de inicio A Tipo I C ARNr 5 S Tipo III A DSE PSE TATA B ARNt U 2 -U 6 T. brucei

Promotor para ARN-pol I • Transcribe: ARN ribosomal (nucleolo) y genes de Ags de superficie (VSG y PRO) • ARNr maduro: 20% 5’PO 4 y 80% 5’ OH • Promotor parecido de los eucariotas superiores Punto de inicio – 170 – 150 – 130 – 110 Upstream control element – 60 – 40 – 20 – 10 +20 Core promoter Pol I Dom III (distal) Dom II Dom. I

Promotor para ARN Pol I Aparentemente están siempre activos (regulación de las unidades de VSG y de PRO? ). Core Suficiente para transcribir VSG Se estimula la actividad por la presencia de elementos en el 5’ (UCE)

VSGs Variant Surface Glycoprotein T. brucei: Inmunofluorescencia de formas sanguíneas usando Acs contra VSG 221 VSG VO 2

VSG Cambio de Expresión • Cada cambio se acompaña de un pico de parasitemia Genes VSG: copia ligada a la expresión (ECL) 1. Southern blot: ADN de distintas poblaciones del parásito, Digestión con enzimas de restricción, Electroforesis en gel de agarosa, Transferencia a membrana de nylon, Hibridización. 2. Hirbridización con un ADNc de una población (pej. b) Copia Básica (BC) Copia ligada a la expresión (ECL) a b c d. . . etc Más del 50% de los genes VSGs siguen este patrón

La formación del ELC ocurre por conversión génica VSG(tel-inact) VSG(interno) VSG(tel-act) VSG(copia-act) VSG(tel-inact) VSG(interno) VSG(tel-act) VSG(interno) VSG(tel-inact)

ARN pol mitocondrial (mit. ARNpol) El ADN en el kinetoplasto está distribuído en: maxi-(30 -50 kb) y mini-(0. 8 -1. 6 kb) círculos 10 -30 copias 30000 -50000 copias genoma mitocondrial ARNguias No se han encontrado secuencias promotoras consenso Transcribe ARN poli-cistrónicos que luego se procesa (corte en ARN monocistrónicos seguido/acompañado de editado (+/-U), poli-A para ARNm y poli-U para ARNg) NOTA: en el núcleo se transcriben: . el ARN mit. ARNpol, que se sintetiza en el citosol (1 subunidad). los ARNt del kinetoplasto y se deben importar

RET 1 (RNA editing TUTase 1).

Editado • Modificación de información génica codificada en el ADN • Se adicionan o se remueven bases del ARNm (en general se introducen o se sacan “U”) • Ocurre en la mayor parte de los ARN mitocondrial. • Se corrige el marco de lectura. Simple: número pequeño de U en el extremo 5´ cox 2 T. brucei Extensa: 60% del ARNm maduro no codificado por el gen > 50% de los genes de T. brucei mitocondriales, ej. Cox 3

Editado ARNg • Todos los ARNg tienen su propio gen en el minicírculos mitocondriales (salvo el 3’ de COXII) • Son pequeños (40 -70 nts) y no sufren edición. anclas • El extremo 5’ de cada ARNg es pre-ARNm complementario a la secuencia cercana a 5’ 3’ la región editada hacia el 3’ del m. RNA. • El extremo 3’ de los g. RNAs tienen una cola de U (5 -15 nts), agregada por una terminal uridil transferasa (TUTasa). • La región intermedia contiene la secuencia complementaria a la porción editada del m. RNA. (AU, GC y GU) 3’ 5’ ARNg Seq guía de edición • Editosoma: corta el transcripto y agrega Us (TUTasa), mantiene los extremos abiertos, elimina las Us no apareadas (exoribonucleasa Uespecífica) y liga los extremos del transcripto m. RNA editado.

al. 1990

Tb. RGG 2

Editado Algunas consideraciones Armar marcos de lectura: - crear codón de inicio y de terminación, - establecer marcos de lecturas funcionales La edición es esencial para la diferenciación en T. brucei Las cantidades relativas de ARNm editado y sin editar varía en los diferentes estadios (¿mec. de regulación? )

La edición alternativa del RNAm de la citocromo C oxidasa mitocondrial III (COXIII) en Trypanosoma brucei produce una nueva proteína de unión a ADN: AEP-1 sería una estructura que enlaza físicamente el k. ADN y cuerpos basales flagelares.

La expresión en tripanosmátidos… • Entender la regulación la expresión génica ayudaría a comprender procesos (diferenciación, virulencia, variación antigénica) y a encontrar blancos claves para controlar la infección. • Mecanismo de expresión único (transcrip policistrónica, transsplicing, editado de ARNm, la ARNpol I sintetiza ARNm). • La iniciación de la transcripción de genes de proteínas parece ser comparable a los promotores sin caja TATA de humanos y otros mamíferos (cr 1 de L major). • La transcripción no parece ser atípica ya que se han identificado factores de transcripción generales diferentes a los eucariotas superiores.

¿PREGUNTAS?