Travaux pratiques de biochimie 30 h Assistante Latitia
Travaux pratiques de biochimie (30 h) Assistante : Laëtitia Colignon Elève-assistant : Léandro Smacchia Contact : laetitia. colignon@umons. ac. be Pentagone 3 E 13
Introduction Les travaux pratiques de biochimie ont pour but d’illustrer les notions théoriques vues aux cours du Professeur Ruddy Wattiez. Chaque jour sera dédié à l’extraction, la mise en évidence et la purification de différentes macromolécules : ØProtéines ØADN ØSucres ØLipides Groupes : 4 ateliers et 4 groupes (de 2 -3 étudiants) par atelier.
Evaluation Consignes : 1 rapport par groupe Deadline : Groupe A : 28/11 minuit Groupe B : 26/12 minuit N. B. : le rapport peut être commencé lors des séances. Forme : word/pdf d’une trentaine de pages maximum A uploader sur Moodle : Nom 1 – Nom 2 – Nom x_ Tpbiochimie 20 -21
Evaluation Structure pour chaque atelier : - Page de garde (noms, date) - Buts - Introduction (théorie nécessaire pour comprendre les expériences) - Résultats (tableaux, graphiques, …) - Discussion (analyse approfondie des résultats de l’expérience) - Conclusion - Bibliographie
Evaluation « Le plagiat est une faute d'ordre moral, civil ou commercial, qui peut être sanctionnée au pénal, elle consiste à copier un auteur ou accaparer l'œuvre d'un créateur dans le domaine des arts sans le citer ou le dire, ainsi qu'à fortement s'inspirer d'un modèle que l'on omet, délibérément ou par négligence, de désigner. Il est souvent assimilé à un vol immatériel. » Plagiat — Wikipédia Bannissez le CTRL + C !
Travail au laboratoire Remarques préalables : • Port du tablier de laboratoire et gants obligatoire! Prise de conscience du matériel de sécurité en cas d’incident. • Port du masque obligatoire! • Ne pas manger ni boire dans le laboratoire • Bien suivre les instructions, comprendre l’expérience avant de commencer. Briefings et Débriefings. • Ne pas manipuler les solvants ou autre produit toxique en dehors des hottes prévues à cet effet! • Bien annoter les échantillons! • Bien respecter le matériel! • micropipettes • balance • Spectrophotomètre • Bien nettoyer les paillasses + matériel + désinfection à l’alcool !!
Atelier 1 – les protéines v. Séparation de protéines par colonne de chromatographie v. Dosage de protéines par spectrophotométrie
Atelier 1 – les protéines v Séparation de protéines par colonne de chromatographie - Chromatographie d’exclusion stérique : séparation selon la taille, mesure des volumes d’élution. - Phase stationnaire : Sephadex (G 10, 20, 30, …). Polymères de dextran hydrophile, différents domaines de réticulation. - Phase mobile : Na. Cl Déroulement de l’expérience : - Couler 2 colonnes (G 50 et G 100) - Séparation de 3 molécules : Ø Blue dextran (2. 000 Da) Ø Hémoglobine (65. 000 Da) Ø Ferycianine de K (329 Da)
Atelier 1 – les protéines v Séparation de protéines par colonne de chromatographie Déroulement de l’expérience : - Mesure des volumes d’élution - Droite d’étalonnage (volume d’élution sur taille des molécules)
Atelier 1 – les protéines v Dosage de protéines par spectrophotométrie Deux types d’absorption utilisées : (1) Absorbance dans les UV : Pour les protéines : § 280 nm pour les aa aromatiques § 230 nm pour les lien peptidiques
Atelier 1 – les protéines v Dosage de protéines par spectrophotométrie Formule de Beer Lambert :
Atelier 1 – les protéines v Dosage de protéines par spectrophotométrie Déroulement de l’expérience : • Mesurer l’absorbance à 280 nm d’une solution de BSA afin d’en vérifier la concentration exacte (nécessaire pour le dosage de Bradford) • Réaliser un spectre d’absorption dans l’UV d’une solution de blanc d’œuf entre 250 et 350 nm, ceci afin de démontrer que le pic d’absorbance des protéines est bien à 280 nm. Cuvette en quartz!
Atelier 1 – les protéines v Dosage de protéines par spectrophotométrie (2) Dosage de Bradford : Basé sur la fixation non covalente d’un colorant, le bleu de Coomassie L’interaction avec les groupements fonctionnels basiques et/ou aromatiques des protéines permet le passage de la forme cationique vers anionique (595 nm). Déroulement de l’expérience : - Droite d’étalonnage (BSA) - Détermination de la concentration en protéines dans le blanc d’œuf Cuvettes plastiques !
Atelier 2 – l’ADN v. Extraction et précipitation v. Dénaturation et mesure de la densité optique
Atelier 2 – l’ADN v. Extraction et précipitation Extraction de l’ADN à partir du thymus de veau (Rapport nucléocytoplasmique élevé) Déroulement de l’expérience : - Destruction des membranes cellulaires (citrate de sodium) - Séparer les protéines de l’ADN (centrifugation) - Dissocier les histones (SDS) - Précipiter les protéines (Na. Cl) - Précipitation de l’ADN (alcool) - Observations
Atelier 2 – l’ADN v. Dénaturation et mesure de la densité optique Le coefficient d'extinction molaire ε de la molécule est augmenté au cours de la transition double brin → simple brin.
Atelier 2 – l’ADN v. Dénaturation et mesure de la densité optique Déroulement de l’expérience : - Faire chauffer l’ADN et mesurer la DO régulièrement à 260 nm - Déterminer le pourcentage en GC Cuvettes en quarts!
Atelier 3 – les lipides v. Séparation de différents groupes de lipides Triglycérides Stéroïdes Phospholipides
Atelier 3 – les lipides v. Séparation de différents groupes de lipides 3 groupes de lipides : - Graisse neutre - Phospholipides - Stéroïdes Comparaison des contenus en lipides de 2 tissus différents : le lard et la cervelle de porc. Déroulement de l’expérience: - Extraction chloroforme/méthanol - Précipitation des phospholipides (sels de cadmium) - Saponification : - Cervelle : ampoule à décanter (séparation savons et stéroïdes) - Lard : précipitation des acides gras - Acide acétique - Ca. Cl 2
Atelier 4 – les glucides v. Tests de révélation de carbohydrates v. Digestion de glucose par les levures
Atelier 4 – les glucides v. Tests de révélation de carbohydrates Carbohydrate = plusieurs unités aldéhydiques ou cétoniques polyhydroxylées. Ø Coloration de Fehling (oxydoréduction du cuivre) sur 4 sucres différents : glucose, fructose, amidon et sucrose. Bleu Rouge En milieu alcalin, le cétose est isomérisé en aldose et se comporte donc comme un sucre réducteur. Déroulement de l’expérience: - Mise en contact (bain marie 100°C) - Expliquer les différents résultats.
Atelier 4 – les glucides v. Tests de révélation de carbohydrates Ø Coloration de Tollens (miroir d’argent) : (oxydoréduction de l’argent) sur 4 sucres différents : glucose, fructose, amidon et sucrose. Déroulement de l’expérience: - Préparation du réactif de Tollens. - Ajout des solutions à tester. - Expliquer les différents résultats.
Atelier 4 – les glucides v. Digestion de glucose par les levures Fermentation alcoolique (anaérobie) C 6 H 12 O 6 + 2 ADP + 2 Pi 2 C 2 H 5 OH + 2 CO 2 + 2 ATP Mesure du métabolisme de la levure par titration du CO 2 produit, capté par du Na. OH en fiole conique (anaérobie). Ne pas oublier de mesurer le nombre de mole de HCl nécessaire pour neutraliser 0. 6 ml de Na. OH 3 M.
Formation des groupes Groupes ?
Formation des groupes Groupes Mardi Mercredi Jeudi Vendredi 1à 2 Protéine ADN Lipide Glucide 3à 5 ADN Lipide Glucide Protéine 6à 7 Lipide Glucide Protéine ADN 8 à 10 Glucide Protéine ADN Lipide
Utilisation du matériel q. Système de sécurité, que faire en cas de brûlure physique/chimique q. Comment mettre/retirer des gants? q. Utilisation de la balance q. Utilisation du spectrophotomètre q. Utilisation des micropipettes q. Droite de calibration avec excel
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