Transmisivn spongiformn encefalopatie STTN VETERINRN SPRVA ESK REPUBLIKY
Transmisivní spongiformní encefalopatie STÁTNÍ VETERINÁRNÍ SPRÁVA ČESKÉ REPUBLIKY MVDr. Josef Holešovský ústřední ředitel
Transmisivní spongiformní encefalopatie Zvířata Lidé Scrapie (1732) TME (1946) CWD (1980…) BSE (1985) FSE (1991) CJD (1920) Kuru ? v. CJD (1996)
Obecná charakteristika • dlouhá inkubační doba • degenerace neuronů, mozku a prodloužené míchy • poruchy chování a pohybu • onemocnění končí vždy smrtí • původce: priony (dříve „pomalé viry“, obecně nekonvenční agens)
Priony • jedinou známou komponentou je prionový protein (Pr. P) • neobsahují nukleovou kyselinu, snášejí UV záření • zvláštní molekulární struktura • ne zcela jasné mechanizmy replikace • nevyvolávají imunitu • vysoká rezistence - 1210 C více než 1 hodinu - 2400 C více než 1 minutu - desinfekční prostředky
Zdravé neurony • mají v buněčných membránách prion protein celulární - Pr. PC • Pr. PC - pravděpodobná účast na přenosu signálu v synapsích - v mechanizmu paměti, spánku - regeneraci • gen pro jeho tvorbu je u člověka lokalizován na 20. chromozomu
Teorie vzniku prionů • Při kontaktu Pr. PC působí Pr. PSC jako matrice • Změna terciární struktury Pr. PC • Vznik patologické izoformy, menší molekuly • • Pr. PC - 254 aminokyselin Pr. PSC - 142 aminokyselin Pr. PC - helix - 43%, list 3% Pr. PSC - helix - 30%, list 43%
Metodou FTIR (Fourier Transform Infra-Red spectroscopy) bylo prokázáno, že Pr. Pc je tvořen ze 42% strukturou a -helix a minimálně (3%) strukturou b-listu a Pr. Psc vykazuje vysoký podíl (43%) b-listu a nižší podíl a -helixu (30%).
Typy prionů • • Čtyři typy prionů Rozdíl v poměru mono-, di- a neglykosylovaných molekul Rozdíl k vnímavosti případného štěpení proteinázou K Typy I - III mají převážně mono- či neglykosylované molekuly U typu IV (vyvolává v. CJD) převládají diglykosylované molekuly
Patogeneze Velký význam imunitního systému • Folikulární dendritické buňky • Transport prionů - do Payerových plaků - do sleziny • Odtud autonomními viscerálními nervy do CNS • Splenektomie a imunosuprese výrazně snižuje vnímavost k experimentální infekci • (význam B-lymfocytů v šíření prionů? )
- infekční forma prionu ( Pr. PSc , Pr. PBSE ) vzniká v organismu tranformací normálního přirozeně se vyskytujícího prionu (Pr. PC) - při proniknutí Pr. PSc do mozku způsobuje řetězovou reakci konverze Pr. PC na patologickou formu a exponenciální nárůst jeho přítomnosti v mozku. Nárůst množství Pr. PSc koreluje s nárůstem infekciozity
Geneticky podmíněná vnímavost • Scrapie Kodon 171 - 90% nemocných homozygoti Glutamin / Glutamin • CJD Kodon 129 - homozygoti Metionin / Metionin - 68% klasická CJD - téměř 100% nemocní v. CJD
Diagnostika • histologické vyšetření mozku vakuolární degenerace neuronů spongiformní vzhled • imunohistochemie, ELISA • CZ - hlavně Westernblot - Prionics. Check • v elektronovém mikroskopu - fibrily Sérologické vyšetření není možné • priony nejsou antigenní, organizmus proti nim nevytváří po infekci protilátky Vývoj metod in vivo • důkaz proteinu 14 -3 -3 a další
Podmínky provádění laboratorního vyšetření na BSE SVS stanovuje podmínky k provádění laboratorní diagnostické činnosti v zařízeních určených ze zákona pro veterinární laboratorní diagnostiku (§ 43, odst. 2) a dále podmínky pro vydání povolení k provádění této diagnostické činnosti v odůvodněných případech v laboratorních zařízeních fyzických a právnických osob (§ 50, odst. 1)
Podmínky provádění laboratorního vyšetření na BSE Diagnostické testy Pro diagnostiku BSE mohou být používány pouze validované testy uznané oficiální autoritou a uvedené v seznamu doporučených diagnostických metod OIE. Komerční testy musí být schválené pro použití podle § 65 zákona č. 166/1999 Sb. , o veterinární péči, v návaznosti na příslušná legislativní nařízení EU.
Diagnostické testy I Rychlé testy imunoblotting test založený na principu Western blot pro detekci proteáza-rezistentního fragmentu Pr. PRes (Prionics -Check) chemiluminiscenční ELISA test, zahrnující extrakční postup a metodiku ELISA, při použití vylepšeného chemiluminiscenčního reagens (Enfer TSE) sendvičovou imunoanalýzu pro Pr. PRes, provedenou po denaturaci a koncentraci (Bio-Rad Platelia )
homogenizace ošetření enzymem separace v gelu
transfer proteinu na membránu imunologická detekce s chemiluminiscencí
detekce signálu na citlivý film
Prionics Check BSE Dušejov - pozitivní nálezy BSE Světnov Scrapie Helvíkovice Scrapie Loukov
Diagnostické testy II histologická metoda pro průkaz charakteristických degenerativních změn v CNS, elektronmikroskopická metoda pro průkaz specifických fibril SAF (scrapie associated fibrils) v homogenizátu mozkomíšní tkáně, imunohistochemická metoda (IHC) pro průkaz proteáza-rezistentního prionového proteinu ve tkáních CNS Jako konfirmační testy se používají histologická a imunohistochemická metoda
Diagnostické laboratoře Pro diagnostiku TSE na území ČR jsou v současné době schváleny laboratoře Státních veterinárních ústavů : SVÚ Praha 6 (NRL) 5. 1. 2001 Prionics-Check , histologie , IHC SVÚ Jihlava 5. 2. 2001 Prionics-Check , histologie , IHC SVÚ Olomouc Enfer TSE 1. 10. 2001
Podmínky provádění laboratorního vyšetření na BSE Bezpečnost práce Práce musí být prováděny v laboratořích splňujících požadovaná kriteria bezpečnosti. Veškeré práce s biologickým materiálem, při kterých je možnost vzniku aerosolů, musí být prováděny bezpečnostním boxu s laminárním prouděním třídy II. (biohazard II). Personál je povinen používat při práci určené ochranné pomůcky a ochranný oděv.
Bovinní spongiformní encefalopatie • První případy 1985/86 ve V. Británii • Výrazný nárůst 1987/88, vrchol 1992/93 • Řada dalších zemí sporadický výskyt ZDROJ zkrmování masokostních mouček • Zákaz zkrmování ve V. Británii, říjen 1988 • Zákaz používání mozku skotu pro lidskou výživu ve V. Británii 1989
Klinika Inkubační doba 2 - 8 roků i déle • Onemocní jen ojedinělá zvířata ve stádě !!! • Zpočátku nevýrazná změna chování - lekavost, neklid, předrážděnost, neovladatelnost • Později - agresivita, nekoordinované pohyby, parézy, paralýzy, hubnutí, snížení užitkovosti, ulehnutí • Onemocnění končí vždy úhynem
Rozšíření prionů v organizmu Testem inokulací myší bylo zjištěno: • u BSE se priony nacházejí především v mozku, prodloužené míše, míše a sítnici • další výskyt slezina, thymus, mandle, střeva s mízními uzlinami, kostní dřeň • ve svalovině ani v mléce nebyly priony prokázány
Výskyt BSE v závislosti na věku Analýzou 177 500 BSE+ ve V. B. zjištěno: • 98 % zvířat starších 40 měsíců • 0, 17 % zvířat ( 307 ks) starých mezi 35 - 40 měsíci • 0, 05 % zvířat (81 ks) starých mezi 30 - 35 měsíci • 0, 006 % zvířat (10 ks) starých mezi 24 - 30 měsíci • 1 zvíře pozitivní ve věku 20 měsíců Minimální inkubační doba po exp. inf. - 35 měsíců Infekčnost mozku nejdříve za 32 měsíců po exp. inf.
Opatření Specifikovaný rizikový materiál • Skot starší 12 měsíců Lebka včetně mozku, očí, mandlí a míchy Střevo od dvanáctníku po konečník • Ovce totéž + slezina Zpracování specifikovaného rizikového materiálu ve vybraném asanačním ústavu a spálení
Možnosti desinfekce a likvidace • Autokláv s přehřátou parou 1340 C, 2 cykly po 1 h • 5 % roztok chlornanu sodného, 2 - 3 h • Materiály a plochy - 5 % chlornanu sodného po 3 h • Alkalická hydrolýza při 1500 C, 5 barech po několik hodin (výroba želatiny z kostí) • Kafilerie - 1330 C - alespoň 20 min. 3 bary • Nejlépe spálení
Nebezpečí pro člověka • pozor na iatrogenní infekce! - transplantace - biopsie - hormony - chirurgické nástroje aj. • V ČR nebyla v. CJD prokázána
- Slides: 29