TRANSFORMACIN Fred Griffith 1928 estudi Streptococcus pneumoniae Conclusin

TRANSFORMACIÓN

Fred Griffith 1928, estudió Streptococcus pneumoniae Conclusión: Las células R “absorbieron” “algo” de las células S “principio transformante”

El Principio transformante es DNA!

TRANSFORMACIÓN CAMBIO HEREDABLE EN UNA CÉLULA U ORGANISMO PRODUCIDO POR LA INTRODUCCIÓN DE DNA EXÓGENO Puede ser: NATURAL (se han encontrado aproximadamente 40 especies que pueden realizar este proceso) ARTIFICIAL (INDUCIDA)

TRANSFORMACIÓN ¿Para qué tomar DNA exógeno? . . Grandes maquinarias proteícas intervienen en el proceso de transformación I. Algunas hipótesis que no son excluyentes…. . Para la diversidad genética (por ejemplo: obtener resistencia a antibióticos) II. Para la reparación de DNA III. Como nutrientes: El DNA es fuente de carbono, nitrógeno y fósforo

SEMEJANZAS Y DIFERENCIAS TRANSFORMACIÓN vs CONJUGACIÓN ¿existe DNA libre en todos los ambientes, es estable?

TRANSFORMACIÓN NATURAL, las bacterias más estudiadas son GRAM + Streptococcus pneumoniae GRAM Neisseria gonorrhoeae Bacillus subtilis Haemophilus influenzae El proceso de transformación se puede dividir en 2 ETAPAS ETAPA 1: Desarrollo de un estado competente ETAPA 2: Procesamiento del DNA Unión Importe Recombinación

Etapa 1: Desarrollo de un estado competente ¿Qué es una célula competente? Estado fisiológico inducible Factores que inducen el estado de competencia en la transformación natural: Limitación en los nutrientes Mitomicina C Alta densidad celular Temperatura, p. H La transcripción de los genes com se inducen durante el estado de competencia Velocidad de transferencia: 90 -100 nucleótidos/segundo a 30°C

La transcripción de los genes com se inducen durante el estado de competencia

TRANSFORMACIÓN ARTIFICIAL El “caballito de batalla” es la bacteria Escherichia coli Es una técnica fundamental en biología molecular: clonación y generación de organismos transgénicos

PLÁSMIDOS

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA: OBTENER BACTERIAS RESISTENTES A KANAMICINA Escherichia coli Medio LB + KANAMICINA

En la transformación artificial ¿cómo se induce el estado competente de una bacteria? 1. Tratamiento químico 2. Electroporación

Preparar células competentes de E. coli A= d

LA TRANSFORMACIÓN SE REALIZARÁ POR CHOQUE TÉRMICO

A nivel molecular

Electroporación

Utilizaremos el plásmido p. ET-TEM Sitio múltiple de restricción Gen que confiere resistencia a kanamicina: kanamicina fosfotransferasa Origen de replicación

Enzimas inactivadoras de aminoglucósidos: La resistencia de las cepas se hace por síntesis de enzimas generalmente codificadas por plásmidos. La inactivación de los aminoglucósidos se hace por: 1. Adenilación de grupos hidroxilo. 2. Fosforilación de grupos hidroxilo. 3. Acetilación de grupos amino. ENZIMA INACTIVADORA AMINOGLUCÓSIDO INACTIVADO: Gentamicina adeniltransferasa Gentamicinas, Sisomicina, Kanamicinas, Tobramicina. Gentamicina acetiltransferasa Netilmicina, Tobramicina, Gentamicinas, Sisomicina. Kanamicina acetiltransferasa Netilmicina, Amikacina, Neomicina, Kanamicinas, Tobramicina, Gentamicinas, Sisomicina. Neomicina, Kanamicina fosfotransferasa Gentamicina A, Neomicina, Kanamicina

TRANSFORMACIÓN: HERRAMIENTA ÚTIL EN EL CAMPO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR VECORES GENÉTICOS: molécula de DNA que es usada como vehículo para transportar segmentos de DNA foráneo en una célula huésped,

ESQUEMA GENERAL SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para que adquieran resistencia a un antibiótico SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de Lisis alcalina SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio

Células no transformantes Medio Luiria + KANAMICINA