Transcrio e Processamento de RNA Agradecimentos Profa Dra

Transcrição e Processamento de RNA Agradecimentos: Profa. Dra. Aline Maria da Silva Instituto de Química- USP Bibliografia: Genes VII - Benjamin Lewin Biologia Molecular Básica-Arnaldo Zaha Lenhinger Principles of Biochemistry (3 a. Ed. )

- Processo para síntese de todos os RNAs da célula Replicação Transcrição Reversa - Reflete o estado fisiológico da célula - O conjunto de genes expressos em uma dada situação é variável Replicação de RNA Tradução Proteína - Processo catalisado pelas RNAs polimerases

Principais Tipos de RNA mensageiro (m. RNA): contém a informação genética para a sequência de aminoácidos das proteínas RNA transportador (t. RNA): identifica e transporta os aminoácidos até o ribossomo RNA ribossômico (r. RNA): constituinte dos ribossomos

t. RNA -Estrutura secundária com grampos e alças formando um trevo -Alto número de bases modificadas depois da sua transcrição

Bases modificadas nos t. RNAs

Processamento do precursor do t. RNA Modificação das bases Processamento t. RNA maduro

Ribossomo bacteriano 70 S (2, 7 x 106) r. RNAs: Ribossomo Eucariótico 80 S (4, 6 x 106)

Processamento do precursor do r. RNA precursor 30 S Metilação das bases Clivagem RNAs maduros

Exemplos de r. RNAs: - Estrutura secundária com grampos e alças - Bases metiladas

E. coli:

Transcrição DNA fita codificadora DNA fita molde RNA transcrito

Síntese de RNA: formação da ligação fosfodiester envolve o ataque nucleofílico do 3’ OH da cadeia crescente no fosfato do carbono 5´do ribonucleosídeo trifosfatado que será incorporado A RNA polimerase não requer um iniciador (primer) para iniciar a síntese do RNA

Bolha de transcrição RNA polimerase Fita molde Direção da transcrição

Direção da transcrição

RNA polimerase de E. coli

RNA polimerase de E. coli As RNA polimerases não tem mecanismo de correção de erro (taxa de erro 10 -5) Ligação ao promotor Centro catalítico Reconhecimento específico do promotor

Promotores de genes bacterianos Região -35 Região -10 Posição +1

Reconhecimento e Ligação ao promotor Início da Transcrição Deslocamento da subunidade sigma

Marcação do DNA com 32 P Footprinting de DNA Tratamento com DNAse Regiões ligadas a RNA polimerase Separar os fragmentos em uma eletroforese em gel de poliacrilamida. Visualizar fragmentos após exposição a filme de Raio-X

Substituição do fator sigma controla a iniciação: Os distintos fatores sigma reconhecem promotores diferentes

Bolha de transcrição RNA polimerase Fita molde Direção da transcrição 5´ 3´

Terminação da transcrição através da formação do grampo de terminação

Terminação da transcrição dependente da proteína Rho (46 k. Da, ativa como hexâmero) move-se ao longo do RNA acompanhando a RNA polimerase Com a pausa da RNA polimerase na sequência de terminação, Rho alcança a enzima Rho desenrola o híbrido RNA-DNA Sequência de Terminação dependente de Rho: rica em C

A RNA polimerase bacteriana é inibida por rifamicina (liga a subunidade beta) A subunidade beta da RNA pol contem 5 sítios de ligação para rifamicina O antibiótico previne o início da síntese da cadeia de RNA, imediatamente após a formação da primeira ligação fosfodiester

Actnomicina D Acridina Agentes intercalantes inibem tanto a transcrição com a replicação, em procariotos e eucariotos

0 gene geralmente é maior do que a sequência codificadora para a proteína 5´UTR 3´UTR Proteína UTR: Região não traduzida (Untranslated region)

0 m. RNA bacteriano pode ser policistrônico (poligênico) 5´UTR Distância intergênica (-1 a 40 bases) Gene B Gene A início 3´UTR fim início fim

Núcleo Transcrição Processamento Transporte Tradução Citoplasma Etapas envolvidas na expressão de genes em eucariotos

RNA polimerases de eucariotos RNA pol I Nucleólo r. RNA Várias subunidades RNA pol II Nucleoplasma hn. RNA Várias subunidades (transcrito primário) sn. RNA pol III Nucleoplasma r. RNA 5 S t. RNAs Várias subunidades RNA pol Mitocondria 01 subunidade RNA pol de Cloroplastos Cloroplasto Similar as bacterianas Requerem proteínas auxiliares: fatores de transcrição

A RNA polimerase II é inibida especificamente por -amanitina Isolado do cogumelo Amanita phalloides Altamente tóxico Bloqueia a etapa de elongação

Estrutura típica de um gene transcrito pela RNApol II Enhancer Promotor Gene

Estrutura de Promotores da RNA Pol II

Promotores de genes transcritos pela RNApol II Tata Binding Protein Complexo TFIID

Promotores de genes transcritos pela RNApol III e I: A TBP também é componente dos complexos de iniciação de transcrição destes promotores

Domínios dos Fatores de Transcrição Domínio de Ativação Domínio conector Domínio de ligação ao DNA

Proteínas necessárias para transcrição a partir de promotores reconhecidos pela RNA Pol II

Eucariotos Procariotos Splicing

Adição do 5´CAP (modificação da extremidade 5´do hn. RNA)

Transcrição e adição do 5´cap (hn. RNA) Clivagem, poliadenilação e splicing Etapas para geração do transcrito maduro

Poliadenilação: Adição da cauda poli (A) na extremidade 3´do hn. RNA (transcrito primário): ~200 Adeninas Sequencia sinal para poliadenilação

Splicing: remoção dos introns Genes eucarióticos são em geral interrompidos por introns (hn. RNA)

Mamíferos tem maior número de exons/gene número de

Tamanho de introns em vertebrados é variado Exons que codificam para proteínas são usualmente pequenos

AGGUAAGU-----Pyr---A--NCAGG Remoção de introns pelo “spliceossomo”: associação de ribonucleoproteínas pequenas (sn. RNPs) formando um complexo de 3 x 103 k. Da

Auto-splicing: introns do grupo I

Auto-splicing: introns do grupo I

Auto-splicing: introns do grupo II