TRABALHANDO COM PROTENAS NELSON DAVID L COX MICHAEL

TRABALHANDO COM PROTEÍNAS NELSON, DAVID L. ; COX, MICHAEL M. PRINCÍPIOS DE BIOQUÍMICA DE LEHNINGER. PORTO ALEGRE: ARTMED, 2011. 6. ED. PORTO ALEGRE: ARTMED, 2014.

§Química de proteínas INTRODUÇ ÃO §Purificação de proteína §Milhares de proteínas §propriedades §Atividades §Métodos clássicos tamanho carga propriedades de ligação §Clonagem do DNA §Sequenciamento do genoma

PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA • Tecido • Célula bacteriana Lise celular Fracionamen to • Extrato bruto • Preparação de organelas • Propriedade • tamanho • carga Proteínas em diferentes frações

PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA- FRACIONAMENTO §Solubilidade de proteínas §p. H §Temperatura §concentração de sais ü salting out ü(NH 4)2 SO 4 Fonte: Nehete et al, 2013

PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA- PREPARAÇÃO §EXTRATO PARCIALMENTE PURIFICADO §Diálise: procedimento que separa proteínas de solutos pequenos se aproveitando do tamanho maior das proteínas *remoção do sulfato de amônio da preparação proteica. Fonte: Protein Purification Methods Foundations of Clinical Sciences em comis. med. uvm. edu

CROMATOGRAFIA EM COLUNA §É utilizada pelos métodos mais eficientes para fracionar proteínas §Diferenças na carga das proteínas, tamanho, afinidade de ligação e outras propriedades. §Diferentes tipos de colunas §Proteínas individuais migram com mais rapidez ou lentidão através da coluna, dependendo de suas propriedades Fonte: Lehninger, 6ª ed. 2014

CROMATOGRA FIA DE TROCA IÔNICA § Diferenças no sinal e magnitude da carga elétrica final de proteínas §Permutadores de cátions §Permutadores de ânions §Afinidade é afetada § p. H (que determina o estado de ionização da molécula) § concentração de íons de sais livres § * Otimização (gradiente de p. H ou de sal) Fonte: Lehninger, 6ª ed. 2014

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO POR TAMANHO §Filtração em gel §Separa as proteínas de acordo com o tamanho §A fase sólida consiste em grânulos de polímeros reticulados com poros ou cavidades projetados com um determinado tamanho §Proteínas grandes §Proteínas pequenas §Estimação do tamanho de uma proteína que está sendo purificada Fonte: Lehninger, 6ª ed. 2014

CROMATO GRAFIA DE AFINIDADE §Baseada na afinidade de ligação §Ligante §Ex: Proteínas com função biológica que envolve ligação com ATP § proteínas ligadoras de ATP se ligam à matriz § Lavagem de proteínas que não se ligaram na coluna § Solução contendo uma solução contendo uma alta concentração de sal ou um ligante livre – nesse caso o ATP ou um análogo do ATP. § Eluição da proteína de interesse Fonte: Lehninger, 6ª ed. 2014

HPLC - CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTO DESEMPENHO Fonte: High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) - Ibsen Photonics -

ELETROFO RESE §Separação de proteínas baseada na migração de proteínas carregadas em um campo elétrico §Estimar: § Número de proteínas diferentes em uma mistura § Grau de pureza de uma preparação proteica específica. § Massa molecular §Determinar: PONTO ISOELÉTRICO Fonte: Lehninger, 6ª ed. 2014

ELETROFORESE § Gel de poliacrilamida § retardar a migração de proteínas § carga § massa § Equação: § m: mobilidade eletroforética § E: potencial elétrico § V: velocidade § Z: carga final da molécula § f : coeficiente de fricção (forma de uma proteína) § Forma e tamanho

ESTIMATIVA DA MASSA MOLECULAR DE UMA PROTEÍNA §Dodecil sulfato de sódio (SDS) §Carga negativa: anula a carga intrínseca §Provoca desdobramento da proteína: formas semelhantes §Separação com base na massa molecular §Corante: azul de Coomassie §Comparação com proteínas de massa molecular conhecida Fonte: Lehninger, 6ª ed. 2014

FOCALIZA ÇÃO ISOELÉTRI CA §Ponto isoelétrico: p. H no qual a carga liquida é zero §Uma solução de um anfólito (Base e ácido de baixo peso molecular) §Carga elétrica §Migração das proteínas até que encontre o p. H que coincide com seu p. I §Proteínas com pontos isoelétricos diferentes são, assim, distribuídas de modo diferente ao longo do gel

ELETROFO RESE BIDIMENSI ONAL §Focalização isoelétrica + eletroforese em SDS §É um método analítico mais sensível do que qualquer método eletroforético sozinho §Separa: § proteínas de massa molecular idêntica que diferem em seu p. I § proteínas com valores de pl semelhantes, mas com massas moleculares diferentes.

ENZIMAS §Efeito catalítico que a enzima produz §Pré-requisitos: 1. a equação geral da reação catalisada 2. um procedimento analítico para determinar o desaparecimento do substrato ou o aparecimento de um produto de reação 3. se a enzima necessita de cofatores, como íons metálicos ou coenzimas 4. a dependência da atividade enzimática da concentração do substrato 5. p. H ótimo 6. uma zona de temperatura em que a enzima é estável e

ENZIMAS § 1, 0 unidade de atividade enzimática é definida como a quantidade de enzima que promove à transformação de 1, 0 mmol de substrato em produto §Atividade: que se refere às unidades totais de enzima em uma solução. § Atividade específica é o número de unidades de enzimas por miligrama de proteína total § pureza enzimática.

OUTRAS PROTEÍNAS §Proteínas de transporte: ligação à molécula que elas transportam §Hormônios e toxinas pelo efeito biológico que produzem; (crescimento de certas células em cultura)

OBRIGADA!